O diagnóstico preciso das características morfológicas e metabólicas de um tecido e/ou órgão com a finalidade de identificar alterações patológicas, ou avaliar um determinado tratamento, é de grande importância nas áreas de biologia e medicina. Uma excelente alternativa para este diagnóstico, e que permite uma visualização com resolução celular, são imagens de microscopia óptica. Tradicionalmente, analisam-se as características celulares através de processos histológicos; contudo, mais recentemente essa mesma análise tornou-se possível em tecidos sem a necessidade deste preparo histológico. Fenômenos de óptica não-linear, como a fluorescência devido à absorção de dois fótons e a geração de segundo harmônico, são exemplos de processos que podem ser realizados sem preparo histológico com o objetivo de se obter imagens microscópicas em diferentes profundidades com resolução celular. Este projeto teve por objetivo desenvolver um microscópio óptico de varredura a laser baseado em processos ópticos não lineares, para adquirir imagens de tecidos e órgãos, nas condições in vitro, in vivo e ex vivo. O microscópio óptico montado é composto por: um laser de pulsos ultracurtos sintonizável (Ti:Safira), um sistema de varredura espacial (dois espelhos conectados a galvanômetros e conjugados por dois espelhos esféricos, para varredura lateral, e uma plataforma piezoelétrica para varredura axial), uma lente objetiva (20X, abertura numérica de 1,0, imersão em água e distância funcional de 2,0 mm) e um sistema de aquisição e controle. A resolução lateral obtida foi de (0,8±0,1) μm e axial de (4,4±1,5) μm, suficiente para a realização de imagens com resolução subcelular de tecidos biológicos. Imagens de fluorescência e por geração de segundo harmônico foram obtidas com sucesso a partir de tecido ex vivo de pele e fígado de rato, pele de porco e de membrana corioalantóica. Estas imagens revelaram aspectos tidos como relevantes na análise morfo-histopatológica – como estruturas nucleares e de membrana, e a presença de colágeno, e com vantagens como coleta de informação vinda de diferentes camadas do tecido. A montagem desse sistema apresenta potencial para contribuir em estudos em diagnóstico e tratamento de lesões sejam feitos de modo que, no futuro, essa análise resulte em diagnósticos mais precisos e tratamentos mais efetivos.

Accurate diagnosis of the morphological and metabolic conditions of a tissue and/or an organ is essential to define the presence of pathological changes, and to evaluate the response during a number of treatments. The use of optical techniques for biological tissue imaging is an excellent alternative for this purpose. Such techniques allow non-invasive diagnostic procedures, with cellular resolution, and usually provide almost instantaneous response. The use of nonlinear optical techniques such as fluorescence promoted by two-photon absorption is one example of optical technique in which we obtain images of living tissue with spatial resolution at cellular level. The purpose of this study is the assembly and characterization of a custom-made non-linear microscope. This microscope allows customized adjustment for in vitro, in vivo and ex vivo imaging of biological samples. The excitation is done using a tunable femtosecond Ti:Sapphire laser. Two galvanometer mirrors conjugated by two spherical mirrors are used for the lateral scan and for the axial scan a piezoeletric stage is utilized. The light is focused in tissue by an 20X objective lens, in water immersion, numerical aperture of 1.0, and working distance of 2.0 mm. The lateral resolution obtained was (0.8 ± 0.1) μm and (4.4 ± 1.5) μm for axial resolution, which is sufficient for images with sub-cellular resolution to be achieved in biological tissues. Fluorescence and second harmonic generation images were performed using epithelial and hepatic tissue. Those images revealed aspects considered relevant in morpho-histopathology – such as nuclear and citoplasm membrane structures, and the presence of collagen. By means of the microscope it is possible to have images in different depths of tissues with sub-cellular resolution. The assembly of such an equipment shall represent a potential contribution to diagnostics and lesion treatment fields, so that it may result in more precise detection of diseases and more effective treatments in the future.