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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.76.2011.tde-29082011-095840
Document
Auteur
Nom complet
Alécio Antonio Pimenta Junior
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Carlos, 2011
Directeur
Jury
Thiemann, Otavio Henrique (Président)
Farah, Shaker Chuck
Fietto, Juliana Lopes Rangel
Montanari, Carlos Alberto
Ward, Richard John
Titre en portugais
Estudos estruturais e correlação com a síndrome urolitíase de mutantes da adenina fosforribosiltransferase humana
Mots-clés en portugais
APRT
Fosforribosiltransferase
Urolitíase
Resumé en portugais
A 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento.
Titre en anglais
Structural studies and correlation with urolithiasis syndrome of mutants from human adenine phosphoribosyltransferase
Mots-clés en anglais
APRT
Phosphoribosyltransferase
Urolithiasis
Resumé en anglais
2,8-DHA Urolithiasis is a disease resulting from an inherited disorder that leads to deficiency of APRT, an enzyme of the PRTases group. So far, 18 mutations were found in patients, 7 of which are missense. This work is dedicated to the functional and structural study of these 7 mutations and the deletion ΔF173. Mutants constructions D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F and F173G were obtained in the vector pET-29a (+) and cloned in E. coli. The expression and purification protocols were established and the enzymes were obtained after 1 chromatographic step using the CHTTM Hydroxyapatite Ceramics column in the required purity. The only exception was the mutant I112F that resulted insoluble during expression. A coupled kinetic assay using PPi detection kit was standardized and allowed the kinetic characterization of native hAPRT and its mutants. The mutants had an efficiency loss of an order of magnitude, with the exception of F173G, whose values were comparable to those of native hAPRT. Crystallization trials were performed for all mutants and resulted in crystals for mutants F173G, R67Q and R89Q. These crystals were collected on Macromolecules Crystallography 2 line at LNLS. The datasets are being analyzed and the structures are in the final stages of refinement.
 
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Date de Publication
2011-08-29
 
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