A síntese e incorporação de Selenocisteína em selenoproteínas ocorre co tradicionalmente direcionado pelo códon de terminação UGA. Uma maquinaria única de enzimas e fatores proteicos é necessária para síntese de selenocisteína e decodificação do códon UGA de terminação da tradução para inserção de selenocisteína. Dentre as enzimas envolvidas, está a Selenonofosfato sintetase (SPS2), responsável por catalisar a ativação de seleneto com adenosina 5 trifosfato (ATP) para gerar selenofosfato, o doador de selênio reativo que é substrato da próxima enzima da via para formação de selenocisteína. Estudos recentes identificaram a presença da via de biossíntese de selenocisteína em parasitas kinetoplastidas e subsequentemente a proteína SPS2 de Trypanosoma brucei e Leishmania major foram caracterizadas. Entretanto, trabalhos estruturais e funcionais das enzimas permaneceram não reportados. Dessa forma, este trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos estruturais e funcionais da SPS2 de T. brucei e L. major. Para caracterização da proteína em solução foram empregadas as técnicas de cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese em gel nativo, espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de Raios X a baixo ângulo (SAXS) e ultracentrifugação analítica (AUC). Os resultados obtidos revelaram uma mistura de dímeros e tetrâmeros em solução para ambas SPS2 com predominância de dímeros. Muitas estratégias de cristalização e melhorias na difração foram utilizadas para obtenção de cristais proteicos apropriados para determinação da estrutura cristalográfica das SPS2. Cristais de SPS2 de T. brucei inteira e SPS2 de L. major com N-terminal truncado foram obtidos. Porém, somente a estrutura cristalográfica da proteína SPS2 de Leishmania major com o N-terminal truncado a 1,9 Å de resolução foi determinada. Estudos comparativos entre esta estrutura e outras selenofosfato sintetases mostrou a mesma organização estrutural entre elas. Experimento de complementação funcional das SPS2 truncadas e mutadas pontualmente revelou três resíduos localizados no N-terminal como fundamentais para atividade da SPS2 (Leu33, Thr34; Tyr36 e Leu37, Thr38; Tyr40 para SPS2 de T. brucei e L.major, respectivamente). Análise mutacional baseada nas estruturas cristalográficas indicou que estes resíduos podem estar envolvidos no mecanismo de entrega do selenofosfato para a próxima enzima da via, a Selenocisteína sintase. Isto poderia evitar a difusão de compostos reativos de selênio, resultando em uma eficiência na síntese de selenocisteína. Os resultados aqui apresentados forneceram informações importantes e novas perspectivas a respeito do mecanismo de catalise da enzima selenofosfato sintetase na via de síntese de selenocisteína.

The synthesis and incorporation of selenocysteine in selenoproteins occurs cotranslationally directed by the UGA stop codon. An unique machine of enzymes and protein factors are required for selenocysteine synthesis and decoding of UGA translation termination codon for the insertion of selenocysteine. Among the enzymes involved, Selenonofosfato synthetase (SPS2) is the responsible for catalyzing the activation of selenite with adenosine 5' - triphosphate (ATP) to generate selenophosphate, the reactive selenium donor, which is substrate of the next pathway enzyme to formation of selenocysteine. Recent studies have identified the presence of selenocysteine biosynthesis in parasites Kinetoplastidas and subsequently, the SPS2 protein of Trypanosoma brucei and Leishmania major have been characterized, however, structural and functional studies of enzymes remain not reported. Thus, this present work report biochemical and biophysical studies of SPS2. To characterize the protein in solution, there were employed the techniques of size exclusion chromatography, native gel electrophoresis, dynamic light scattering (DLS), Small angle X-ray scattering angle (SAXS) and analytical ultracentrifugation (AUC). The results revealed a mixture of dimmers and tetramers in solution for SPS2 with predominance of dimers. Many strategies and improvements in crystallization and diffraction were used to obtain suitable SPS2 crystals for determination of the crystallography structure. T. brucei SPS2 crystals and L. major SPS2 crystals with truncated N-terminal were obtained. However, only the structure of SPS2 protein from L. major with truncated N-terminal to 1.9 Å of resolution was solved. Comparative studies of this structure with other selenophosphate synthases revealed the same structural organization. Functional complementation experiments of truncated and mutated SPS2 revealed three residues located in the SPS2 N- terminal as essential for the activity of the enzyme (Leu33 , Thr34 and Tyr36 to T. brucei SPS2; Leu37 , Thr38 and Tyr40 to L. major SPS2) . Mutational analysis based on the crystal structures indicated that these residues may be involved in the mechanism of selenophosphate delivery to the pathway enzyme next, the selenocysteine synthase. This found could prevent the diffusion of reactive selenium, resulting in selenocysteine synthesis efficient. The results presented here provided important information and new insights about the of selenophosphate synthetase catalysis mechanism in the selenocysteine synthesis pathway.