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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.10.2010.tde-02022011-211958
Documento
Autor
Nome completo
Paulo Varoni Cavalcanti
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2010
Orientador
Banca examinadora
Assumpção, Mayra Elena Ortiz D'Avila (Presidente)
Milazzotto, Marcella Pécora
Pesquero, João Bosco
Título em português
Hibridização in situ em espermatozóides bovinos tratados com DNA exógeno: estudo experimental
Palavras-chave em português
Transferência Gênica Mediada por Espermatozóides (TGME). Animais Transgênicos. Eletroporação. Fecun
Resumo em português
Muitas das técnicas utilizadas para gerar animais transgênicos são caras e laboriosas. Neste contexto, a transferência gênica mediada por espermatozóides (TGME) pode ser uma alternativa para a produção em larga escala de animais transgênicos. Estudos de SMGT têm seu foco no número de cópias de DNA incorporada pelo espermatozóide. Por isso, há pouca informação disponível sobre como as moléculas de DNA se comportam durante o processo de fecundação e quais os efeitos dos protocolos de TGME sobre a célula espermática. Neste sentido, com o objetivo de avaliar a existência de sitio de integração preferencial das moléculas exógenas de DNA no genoma hospedeiro, utilizamos a hibridização in situ para acompanhar a veiculação do transgene durante o processo de fecundação. Foram avaliadas as membranas acrossomais, plasmática e potencial de membrana mitocondrial de espermatozóides submetidos a TGME. Para isso, o sêmen de três diferentes touros foram submetidos ao gradiente de Percoll 45-90%. As células viáveis foram incubadas com o vetor recombinante pCX-EGFP (0, 250, 500 ou 1000ng/106 células) seguidas ou não de eletroporação (300v, 35µF e 0,25ms). Os espermatozóides tratados foram utilizados para a produção in vitro de embriões. Os embriões foram cultivados por sete dias até o estágio de blastocisto. Espermatozóides e embriões produzidos in vitro foram submetidos ao ensaio de hibridização in situ, com metodologia descrita Whyte et al. (2000). O potencial de membrana mitocondrial (PMM), integridade de membrana acrossomal (MA) e plasmática (MP) foram avaliados por citometria de fluxo (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) utilizando as sondas fluorescentes JC1, FITC-PSA e PI (Molecular Probes), respectivamente. Os dados foram analisados pelo teste paramétrico ANOVA (teste LSD) usando o programa estatístico SAS for Windows, com nível de significância de 5%. A hibridização in situ não foi possível em espermatozóides bovinos, pois não houve hibridação da sonda controle. Blastocistos oriundos de espermatozóides incubados com DNA exógeno apresentaram integração de forma difusa, embriões oriundos de espermatozóides eletroporados apresentaram integração pontual. As diferentes concentrações de DNA não exerceram efeitos deletérios nas MP ou PMM, a adição de 500ng de DNA causou aumento de lesão na MA (p<0,05). A eletroporação não afeta a MP e MA, mais apresenta grande efeito no PMM causando redução da função mitocondrial. Este estudo conclui que maiores esforços são necessários para elucidar o comportamento das moléculas exógenas de DNA durante o processo de fecundação e quais são os efeitos da TGME sobre a célula espermática.
Título em inglês
In situ hybridization in bovine sperm treated with exogenous DNA: an experimental study.
Palavras-chave em inglês
In vitro fertilization
Incubation.
Sperm Mediated Gene Transfer (SMGT). Transgenic Animals. Electroporation
Resumo em inglês
Most techniques used to produce transgenic animals are laborious and expensive. In this manner, sperm mediated gene transfer (SMGT) may be a viable alternative for long-scale production of transgenic animals. Many SMGT studies have focused the DNA internalization and number of DNA copies incorporated by spermatozoa. However, limited data is available about how foreign DNA molecules behave during fertilization and the direct effects of the SMGT technique on sperm cells. Hence, in order to monitor the existence of preferential integration sites by the exogenous DNA at the host genome, in situ hybridization was used to track the transgene conveyance during in vitro fertilization. In addition, acrosome and plasmatic membrane integrity and mitochondrial membrane potential of sperm cells subjected to SMGT were assessed. Briefly, thawed semen from three different bulls was submitted to a 45- 90% Percoll gradient. Viable cells were incubated with recombinant PCX-EGFP vector (0, 250, 500 or 1000ng/106 sperm cells) or incubated and electroporated (300V, 35µF and 0.25ms). Treated sperm cells were then used for in vitro production of embryos. Embryos were in vitro cultured for 7 days until blastocyst stage. Treated spermatozoa and in vitro produced blastocysts were submitted to in situ hybridization assay, as described by Whyte et al. (2000). The mitochondrial membrane potential (MMP), acrosomal membrane (AM) and plasmatic membrane (PM) integrity were assessed by flow cytometry (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) using JC1, FITC-PSA and PI probes (Molecular Probes), respectively. Data were analyzed by parametric ANOVA (LSD test) using SAS for Windows software, at a 5% level. The transgene was not observed at the bovine spermatozoa because the control probe could not be hybridized. In situ hybridization revealed that blastocysts produced from incubated sperm cells had a diffuse foreign DNA integration while blastocysts produced from electroporated sperm cells had a punctual DNA integration. No deleterious effects of exogenous DNA concentrations on PM or MMP were observed. However, the addition of 500ng of exogenous DNA caused sperm AM injury (P<0.05). Electroporation did not affect PM or AM integrity, but it had a great effect on MMP, which may cause a reduction of mitochondrial function. This study suggest that more efforts are needed to elucidate the behavior of exogenous DNA during fertilization and the effects of SMGT in bovine sperm cells.
 
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Data de Publicação
2011-03-04
 
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