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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.10.2013.tde-26112013-115001
Document
Author
Full name
Fernanda Jordão Affonso
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2013
Supervisor
Committee
Arruda, Rubens Paes de (President)
Bittar, Juliana Nascimento
Celeghini, Eneiva Carla Carvalho
Title in Portuguese
Efeito do uso dos antioxidantes melatonina, ácido ferúlico e mioinositol sobre a motilidade, integridade de membranas e produção de espécies reativas de oxigênio em sêmen equino refrigerado
Keywords in Portuguese
DCFH-DA
FITC-PSA
Fluorímetro
JC-1
PI
Sondas fluorescentes
Abstract in Portuguese
O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração.
Title in English
Effect of the use of the antioxidants melatonin, ferulic acid and myoinositol on motility, membrane integrity and oxygen reactive species production in cooled equine semen
Keywords in English
DCFH-DA
FITC-PSA
Fluoremeter
Fluorescent probe
JC-1
PI
Abstract in English
Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.
 
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Publishing Date
2013-12-04
 
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  • ARRUDA, R. P., et al. Aspects related to the technique and the utilization of sexed semen in vivo and in vitro. Animal Reproduction, 2012, vol. 9, p. 345-353.
  • ARRUDA, R. P., et al. Métodos de avaliação da morfologia e função espermática: momento atual e desafios futuros. Revista Brasileira de Reprodução Animal , 2011, vol. 35, p. 145-151.
  • ARRUDA, R. P., et al. Nutracêuticos na reprodução de garanhões. Revista Veterinária e Zootecnia em Minas, 2011, vol. 109, p. 49-51.
  • AFFONSO, F. J., et al. Efeitos de diluidores e tempo de equilíbrio sobre as características de motilidade, membranas espermáticas e fragmentação do DNA no sêmen de equino sexado pela técnica de citometria de fluxo. In IV Simpósio de Pesquisa e Pós Graduação do Departamento de Reprodução Animal, Pirassununga, 2012. IV Simpósio de Pesquisa e Pós Graduação do Departamento de Reprodução Animal da FMVZ/USP.., 2012. Resumo.
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  • ALONSO, M. A., et al. Effect of hCG application in different days of estrous cycle on uterine and ovarian blood flow and uterine and cervical tone in mares. In 26th Annual Meeting of the Brazilian Embryo Technology Society - SBTE, Foz do Iguaçu-PR, 2012. Proceedings of the 26th Annual Meeting of the Brazilian Embryo Technology Society. : Brazilian College of Animal Reproduction, 2012. Abstract.
  • ARRUDA, R. P., et al. Nutracêuticos na reprodução de garanhões. In V Simpósio Internacional do Cavalo Atleta., Belo Horizonte, 2011. Revista Veterinária e Zootecnia em Minas (V&Z em Minas).., 2011.
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  • SILVA, D. F., et al. Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase (NOS) e da eliminação do óxido nítrico (NO) nos padrões da motilidade e integridade de membrana plasmática e acrossomal do espermatozoide equino criopreservado. In IV Simpósio de Pesquisa e Pós Graduação do Departamento de Reprodução Animal, Pirassununga, 2012. IV Simpósio de Pesquisa e Pós Graduação do Departamento de Reprodução Animal da FMVZ/USP.., 2012. Resumo.
  • SILVA, D. F., et al. Effect of nitric oxide inhibition (n-w-nitro-l-arginine methyl ester) and scavenger (methylene blue) on plasma membrane peroxidation of equine cryopreserved sperm. In Annual Conference of the International Embryo Transfer Society, Hanover, 2012. Proceedings of the 39th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society. : Reproduction, Fertility and Development, 2012. Abstract.
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