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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.10.2016.tde-13052016-110412
Document
Author
Full name
Ana Carolina Furlanetto Mançanares
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2016
Supervisor
Committee
Martins, Daniele dos Santos (President)
Oliveira, Lilian de Jesus
Perecin, Felipe
Silva, Luciano Andrade
Silveira, Juliano Coelho da
Title in Portuguese
O estudo das células Tγδ na manutenção da tolerância materna em vacas gestantes
Keywords in Portuguese
Células Tγδ
Citocinas
Endométrio
Linfócitos T
PBMC
Abstract in Portuguese
O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células Tγδ para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células Tγδ, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células Tγδ foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células Tγδ para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina.
Title in English
Study of gamma delta t cells in maintenance of maternal tolerance in pregnancy in cattle
Keywords in English
Cytokine
Endometrium
Lymphocytes
PBMC
Tγδ cells
Abstract in English
The maternal immune system plays an important role on the establishment and maintenance of pregnancy until the onset of parturition in mammals. Our hypothesis is that there is a recruitment of γδT-cell to the endometrium during pregnancy. These cells express a particular cytokine profile that is important to the establishment and maintenance of maternal toleranceto fetal antigens in cattle. Experiment I - To study the population dynamics of immune cells in the peripheral blood of NLNP, 1st and 3rd trimester of pregnancy, PBMCs were separated by Ficoll density gradient and the abundance of CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ and WC1+ was analyzed by single-color flow cytometry. There was no statistical difference of the abundance of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ among groups of cows. Experiment II To analyze the gene expression profile of 1st trimester, LNP and NLNP. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient and γδT-cells (WC1+) were enriched by magnetic cell sorting. Both PBMC and WC1+ cells gene expression was analyzed for IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 and TNFA by qRT-PCR. Gene expression analysis showed increased expression of the IL1B, IL6 and TGFB2 in PBMC in NLNP compared with 1st trimester of pregnancy and LNP cows, while other genes analyzed showed no significant difference. Experiment III fragments of endometrium were collected from cows at the early (33 to 35 days of pregnancy), mid (143 to 182 days of pregnancy) and late pregnancy (228 to 247 days of pregnancy). Endometrial immune cells were quantified (CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+, and WC1+) by single-color immunofluorescence. There was an increase CD25+ and CD62L+ cells in the endometrium in early pregnancy. In the mid of pregnancy, there was an increase of WC1+ and CD14+ cells. At the end of pregnancy, there was an increase of CD14+, CD25+, CD18+ and CD62L+. In conclusion, our data suggest that the maternal immune system is modulated according to the stage of pregnancy in the cow. In early pregnancy, there is an increased number of endometrial CD25+ cells that may reflect the activation of local immune response and recruitment of putative T-reg cells to the endometrium for an active establishment of maternal tolerance to fetal antigens. While, in mid pregnancy there is a massive recruitment of γδT-cells and CD14+ to the pregnant endometrium perhaps to maintain an tolerogenic microenvironment and to promote tissue remodeling for proper fetal development and growth. Finally, in late pregnancy, there is a recruitment of effector immune cells such as CD62L+, CD18 and CD14+ cells associated with an increased expression of proinflammatory cytokines (i.e. IFNG, IL-6) to play a role on induction of parturition and uterine involution in the cow
 
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Publishing Date
2016-06-14
 
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