Mast cell tumours (MCTs) are common neoplasms in dogs and are considered potentially malignant. Several researches have attempted to identify biomarkers to better predict biological behavior for this tumor. In addition, studies with primary culture of canine MCTs coud be a valuable tool for the analysis of the cells functional properties. The objetive of this study was to identify molecular pathways connected to histopathological malignancies, shorter survival time and poor prognoses associated with MCTs. Moreover, we aimed to investigate the in vitro behavior of mast cells obtained from canine cutaneous MCTs of different histopathological grades and the type of interaction with the stromal fibroblasts. We performed genome-wide gene expression analyses on tissues obtained from 15 dogs with single MCTs, and identified two distinct tumour subtypes - high-risk and low-risk - associated with differences in histological grades, survival times, Ki67 indices, and occurrence of death due the disease. Comparative analyses of RNA sequence profiles revealed 71 genes that were differentially expressed between high and low-risk MCTs. In addition to these analyses, we examined gene co-expression networks to explore the biological functions of the identified genes. The network construction revealed 63 gene modules, 4 of which were significantly associated with the more aggressive tumour group. Two of the gene modules positively correlated with high-risk MCTs were also associated with cell proliferation and extracellular matrix-related terms. At the top of the extracellular matrix module category, genes with functions directly related to those of cancer-associated fibroblasts (CAFs) were identified. Immunohistochemical analyses also revealed a greater number of CAFs in high-risk MCTs. Culture experiments were made immediately after surgical resection and cells were cultured in complete DMEM-F12 for 4 to 7 passages. Mast cells was stained with Romanowsky and toluidine blue and showed progressive loss of their granules in culture. The presence of fibroblasts as adherent cells was confirmed by use of qRT-PCR for Fibroblast-specific Protein 1 (FSP1) gene. The characterization of cultured fibroblasts as myofibroblasts was performed by immunofluorescence for -smooth muscle-actin (SMA) and vimentin. The percentage of viable cells in the supernatant was determined in each passage. During 410 weeks of culture without any addition of growth factors or cytokines, living mast cell population decreased 11 progressively and adherent fibroblasts and myofibroblasts continue to grow until senescence. High-grade MCTs samples were viable for shorter periods in culture (P=0.0442) and lower number of passages (P<0.0001). We also have examined the short-term effects of stroma fibroblasts on neoplastic mast cells in different cultures conditions. The cell-cell contact co- culture was the best condition in which canine neoplastic mast cells remained viable in highest proportion during the experiment compared to all other conditions, i.e. with the transwell condition and mast cells isolated cultures (P<0.05). We also found that isolated neoplastic mast cells are not viable for more than 4 days in the absence of fibroblasts or their soluble factors. These results indicate an important interaction between mast cells and fibroblasts, which may also occur in the tumor microenvirnomental setting.

Os mastocitomas cutâneos (MCTs) são neoplasias comuns em cães e são considerados potencialmente malignos. Diversas pesquisas tentaram identificar biomarcadores para melhor predizer o comportamento biológico deste tumor. Além disso, estudos envolvendo o cultivo primário de MCTs caninos podem ser uma ferramenta valiosa para a análise das propriedades funcionais das células. O objetivo deste estudo foi identificar vias moleculares ligadas a características de malignidade histopatológicas, menor tempo de sobrevida e pior prognóstico associados ao MCT. Além disso, objetivamos investigar o comportamento de mastócitosin vitro obtidos a partir de MCTs de diferentes graus histopatológicos e determinar o tipo de interação com os fibroblastos estromais. Realizamos análises de expressão gênica em MCTs únicos obtidos de 15 cães e identificamos dois subtipos distintos de tumor alto risco e baixo risco - associados a diferenças nos graus histológicos, tempos de sobrevida, índices Ki67 e ocorrência de morte devido a doença. Análises comparativas de perfis de sequência de RNA revelaram 71 genes diferencialmente expressos entre MCTs de alto e baixo risco. Ademais, examinamos redes de co-expressão gênica para explorar as funções biológicas dos genes identificados. A construção da rede revelou 63 módulos gênicos, dos quais 4 foram significativamente associados ao grupo mais agressivo. Dois dos módulos gênicos positivamente correlacionados com MCTs de alto risco também foram associados à proliferação celular e à matriz extracelular. No topo do módulo de matriz extracelular, foram identificados genes com funções diretamente relacionadas àqueles de fibroblastos associados ao câncer (CAFs). Análises imuno-histoquímicas também revelaram um maior número de CAFs em MCTs de alto risco. Os experimentos de cultivo foram feitos imediatamente após a ressecção cirúrgica e as células foram cultivadas em DMEM-F12 completo por 4 a 7 passagens. Os mastócitos foram evidenciados por coloração com Romanowsky e azul de toluidina com perda progressiva de seus grânulos em cultivo. A confirmação de fibroblastos como células aderentes foi feita por qRT-PCR para o gene da Proteína Específica de Fibroblastos 1 (FSP1). A caracterização dos fibroblastos cultivados como miofibroblastos foi realizada por imunofluorescência para -actina de músculo liso (SMA) e vimentina. A percentagem de 9 células viáveis no sobrenadante foi determinada a cada passagem. Durante as 4-10 semanas de cultivo sem adição de fatores de crescimento ou citocinas, a população de mastócitos vivos diminuiu progressivamente e os fibroblastos e miofibroblastos continuam a crescer até a senescência. Amostras de MCTs de alto grau foram viáveis por períodos mais curtos (P =0.0442) e menor número de passagens (P<0.0001). Examinamos também os efeitos a curto prazo dos fibroblastos estromais na viabilidade dos mastócitos neoplásicos em diferentes condições de culturas. O contato célula-célula foi a melhor condição em que maior proporção de mastócitos neoplásicos permaneceu viável em comparação com todas as outras condições, isto é, utilizando-se de inserto e no cultivo de mastócitos isolados (P<0.05). Verificamos também que os mastócitos neoplásicos não ficam viáveis por mais de 4 dias na ausência de fibroblastos ou de seus fatores solúveis. Estes resultados indicam uma importante interação entre os mastócitos e os fibroblastos, que podem ocorrer no microambiente tumoral.