Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.10.2020.tde-06052021-222715
Document
Author
Full name
Guilherme Pereira Scagion
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2020
Supervisor
Committee
Ferreira, Helena Lage (President)
Criado, Miriã Ferreira
Durigon, Edison Luiz
Okino, Cintia Hiromi
Soares, Rodrigo Martins
Title in Portuguese
A ProteÃna ArfGAP com dois domÃnios plaquistrinos 2 (ADAP2) no sistema imune inato de galinhas
Keywords in Portuguese
ADAP2
Antiviral
Grânulos de estresse
Imunidade inata
Interferon
MAVS
Sistema imune de galinhas
VÃrus
Abstract in Portuguese
Aves e mamÃferos possuem algumas semelhanças em seu sistema imune inato, porém também apresentam diferenças pela sua divergência evolutiva. Alguns componentes da via do interferon (IFN) estão ausentes em células de galinha, como o gene RIG-I, IRF 3 e IRF 9. Outros componentes são únicos na resposta imune inata das galinhas, como o gene do receptor do tipo Toll 15 (TLR15). A via do IFN tipo I, ativa os genes estimulados por IFN (ISGs), os quais possuem um importante papel contra os vÃrus, estabelecendo o estado antiviral no hospedeiro. No entanto, os mecanismos moleculares dessa indução em aves são pouco compreendidos e podem ser evolutivamente distintos dos mamÃferos. Em mamÃferos, uma das proteÃnas responsivas ao vÃrus e reguladas por IFN é codificada pelo gene Arf-GAP com dois domÃnios plaquistrinos 2 (ADAP2, também conhecido como CENTA2 e Centaurina-β). A caracterização molecular e biológica da proteÃna ADAP2 de galinha (chADAP2) foi realizada neste estudo. Análises de bioinformática foram realizadas para identificar caracterÃsticas da sequência de aminoácidos desta proteÃna e compará-las com as sequências obtidas de mamÃferos. A expressão do gene chADAP2 foi calculada após a infecção em células de galinha (DF-1) com o vÃrus da influenza aviária (AIV) de dois subtipos (H2N1 e H5N1) em diferentes tempos. A localização da proteÃna chADAP2 e sua interação com a proteÃna MAVS de galinha (chMAVS) e grânulos de estresse (G3BP1) em células de galinhas foi acessada pela microscopia confocal e pela co- imunoprecipitação. A atividade antiviral foi avaliada após a transfecção de plasmÃdeos expressando as proteÃnas de chADAP2 em células infectadas com o subtipo H9N2 do AIV. Nossos resultados mostraram que as sequências de aminoácidos da proteÃna ADAP2 deram origem a dois clusters (mamÃferos e aves) na análise filogenética. Após a infecção com os isolados AIV houve um aumento de expressão do gene chADAP2, entre o perÃodo de 0 a 48 horas em células aviárias. A co-localização entre as proteÃnas chADAP2, MAVS e grânulos de estresse (G3BP1) na região citoplasmática celular foi confirmada pela microscopia confocal. A interação entre chADAP2 e chMAVS foi também comprovada pela co-imunoprecipitação. Finalmente, a atividade antiviral foi confirmada pela diminuição de infecção de AIV em células transfectadas com o plasmÃdeo expressando a proteÃna chADAP2 em células de galinha. O presente estudo identificou que a proteÃna chADAP2 possui um papel semelhante ao descrito pela ADAP2 em células de mamÃferos, apesar da distância genética das sequências de nucleotÃdeos e organização dos domÃnios proteicos entre eles. Nossos dados confirmam a interação entre os grânulos de estresse e as proteÃnas da resposta antiviral, com as proteÃnas chADAP2 e chMAVS envolvidas na cascata para expressão de IFN tipo I. Este é o primeiro relato sobre o papel chADAP2 em células aviárias. Este novo conhecimento sobre a resposta imune inata permitirá o desenvolvimento de ferramentas para o controle de infecções virais em aves.
Title in English
ArfGAP with dual pleckstrin domains 2 protein in the chicken innate immune system
Keywords in English
ADAP2
Antiviral
Chicken immune system
Innate immunity
Interferon
MAVS
Stress granules
Virus
Abstract in English
Avian and mammals have some similarities in their innate immune system, but they also show differences due to their evolutionary divergence. A few components of the interferon (IFN) pathway are absent in chicken cells, such as the RIG-I gene, IRF 3, and IRF 9. Other components are unique in their innate immune response, like the toll- like receptor 15 (TLR15) gene. The type I IFN pathway, activates the IFN-stimulated genes (ISGs), which plays a crucial role against viruses by establishing an antiviral state in the host. However, molecular mechanisms of this induction in avian are poorly understood and can be evolutionarily distinct from mammalian. In mammalian, one of the virus-responsive and IFN-regulated protein is encoded by Arf-GAP with dual PH Domain-Containing Protein 2 gene (ADAP2, also known as CENTA2 and Centaurin -β). Molecular and biological characterization of chicken ADAP2 protein (chADAP2) was performed in this study. Bioinformatics analyses were performed to identify molecular features in the amino acid sequence and compare them to sequences obtained from mammals. chADAP2 gene expression was calculated after infection in chicken cells (DF-1) with avian influenza viruses (AIV) from two subtypes (H2N1 and H5N1) at different time points. The co-localization of chADAP2 protein with the chicken MAVS (chMAVS) and stress granules (G3BP1) in chicken cells was evaluated by confocal microscopy and co-immunoprecipitation. The antiviral activity was evaluated after the transfection of plasmids expressing chADAP2 protein in cells infected with AIV from H9N2 subtype. Our results showed that the ADAP2 amino acid sequences had two clusters (mammals and avian) by phylogenetic analysis. After infection with AIV isolates, an upregulation of the ADAP2 gene was detected from 0 to 48 hours in chicken cells. Confocal microscopy assays confirmed the co-localization of chADAP2, MAVS, and G3BP1 proteins in the cells’ cytoplasmic region. The interaction between chADAP2 and chMAVS has been also proven by co-immunoprecipitation. Finally, the antiviral activity of the chADAP2 was confirmed by a decrease in AIV expression in cells transfected with the plasmid expressing the chADAP2 protein in chicken cells. The present study identified that chADAP2 has a similar role, as described in mammals’ cells, despite their high genetic distances of nucleotide sequences and protein domains organization. Our results confirm the interaction among stress granules and antiviral response proteins, such as ADAP2 and chMAVS proteins involved in the cascade for IFN type I. This is the first report of the chADAP2 role in avian cells. This new knowledge about the innate immune response will allow the development of tools for controlling virus infections in birds.
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Publishing Date
2022-04-11