O uso de ortobiológicos, como o Plasma Rico em Plaquetas (PRP), já é uma realidade na medicina equina há alguns anos, porém segue enfrentando certas limitações relacionadas desde à grande variabilidade de protocolos utilizados até desfechos clínicos por vezes divergentes dos encontrados em ensaios clínicos. Esse estudo foi desenvolvido com dois objetivos principais: validar um protocolo de produção de PRP Liofilizado e Lisado Plaquetário (LP), obtidos a partir de PRP; conduzir um teste pré- clínico mensurando a capacidade anti-inflamatória desses hemocomponentes em co- cultura de tecido articular. Dentre as hipóteses que nos embasaram estão: os hemocomponentes manterão a concentração de fatores de crescimento independente do produto final, e a resposta inflamatória inicial será seguida de resposta resolutiva em ambiente in vitro. A metodologia foi dividida em duas etapas. Primeiramente os três hemocomponentes foram produzidos de seis doadores saudáveis e armazenados em diferentes temperaturas durante 30 dias, sendo mensurados seu conteúdo celular, bioquímico, Fator de Crescimento Transformante β1 (TGF- β1), interleucinas (IL) 1 β, 6 e 10 e Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α). Os hemocomponentes de um doador foram selecionados para armazenamento por até dois anos. Na segunda etapa, as co-culturas foram produzidas com explante de cartilagem e células derivadas de membrana sinovial de seis doadores de tecido articular. Dos oito poços de co-cultura, quatro foram estimulados com lipopolissacarídeo, e cada um dos oito poços recebeu um dos quatro tratamentos: meio de cultura, PRP, PRP liofilizado e Lisado Plaquetário. Os explantes foram avaliados histologicamente e por meio de microscopia eletrônica de varredura. As células foram avaliadas quanto à sua viabilidade ao fim da cultura. Nos sobrenadantes foram mensurados concentração de prostaglandina E2 (PGE2), interleucinas 1 beta, 6 e 10, TNF-α, TGF-β1 e glicosaminoglicanos. Os hemocomponentes produzidos na primeira fase apresentaram concentração semelhante de TGF-β1 quando armazenados a -80ºC por trinta dias e dois anos, com diminuição quando armazenados a -20ºC por um ano. A concentração de citocinas diminuiu drasticamente em todos os hemocomponentes armazenados em temperatura ambiente por 30 dias. Com relação às co-culturas, o tratamento com os ortobiológicos resultou em liberação estável de TGF-β1 ao longo do tempo, PGE2 apresentou maiores concentrações em 0 e 48 h, retornando a valores basais em 144 h, enquanto as concentrações de IL-1β, IL-10 e TNF-α apresentaram aumento nas amostras tratadas com PRP e LP em 144 h. Dermatan sulfato (DS) e Condroitin sulfato (CS) resultaram em valores similares em todos os tratamentos em 144 h. Os protocolos utilizados resultaram em hemocomponentes com características semelhantes entre si quando armazenados a -80ºC por 30 dias, e sua utilização como tratamento em sistema de co-cultura de tecido articular apresentou perfil inflamatório inicial, seguido de possível fase pró-resolutiva, com aumento dos fatores anti- inflamatórios.

The use of orthobiologics, such as Platelet Rich Plasma (PRP), has been a reality in equine medicine for some years now, but it continues to face certain limitations, ranging from the great variability of the protocols used to clinical outcomes that occasionally differ from those found in clinical trials. This study had two main objectives: to validate a protocol for the production of Lyophilized PRP (FD-PRP) and Platelet Lysate (PL), obtained from PRP; conduct a pre-clinical test measuring the anti- inflammatory capacity of these blood components in joint tissue co-culture. Our hypothesis were: the blood components will maintain their level of growth factors regardless of the final product, and the initial inflammatory response will be followed by a resolutive response in an in vitro environment. The methodology was divided into two phases. Firstly, the three blood components were produced from six healthy donors and storaged in different temperatures for 30 days, and their cellular and biochemical content, Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1), interleukins (IL) 1, 6 and 10 and Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) were measured. The hemocomponents from one single donor were selected for storage for up to two years. In the second phase, co-cultures were produced with cartilage explants and synovial membrane derived cells of six joint tissue donors. Of the eight co-culture wells, four were stimulated with lipopolysaccharide, and each of the eight wells received one of four treatments: culture medium, PRP, lyophilized PRP and platelet lysate. The explants were evaluated histologically and using scanning electron microscopy. The cells were evaluated for their viability at the end of culture. The concentration of prostaglandin E2 (PGE2), interleukins 1, 6 and 10, TNF-α, TGF-β1 and glycosaminoglycans were measured on the supernatants. The blood components produced on the first phase of this study showed a similar concentration of TGF-β1 when stored at -80ºC for 30 days and 2 years, decreasing when stored at -20ºC for 1 year. The concentration of cytokines decreased drastically in all blood components stored at room temperature for 30 days. Regarding co-cultures, treatment with orthobiologicals resulted in stable release of TGF-β1 over time, PGE2 showed higher concentrations at 0 and 48 h in every treatment, returning to basal concentrations at 144 h, while IL-1β, IL-10 and TNF-α showed an increase in wells treated with PRP and PL at 144 h. Dermatan sulfate and Chondroitin sulfate resulted in similar values in all treatments at 144 h. In conclusion: the protocols used resulted in blood components with similar characteristics when stored at -80ºC for 30 days, and their use as a treatment in a joint tissue co-culture system presented an initial inflammatory response, followed by a possible pro-resolutive phase, with an increase of anti- inflammatory factors.