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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.100.2018.tde-21052018-223214
Document
Author
Full name
Nathalia Ruder Borçari
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2018
Supervisor
Committee
Dantas, Viviane Abreu Nunes Cerqueira (President)
Cunha, Fernanda Marques da
Narchi, Nadia Zanon
Pereira, Belmiro Gonçalves
Title in Portuguese
Efeito da progesterona na expressão de genes envolvidos no estresse oxidativo e defesa antioxidante em células beta pancreáticas: uma abordagem in vitro para o estudo do diabetes gestacional
Keywords in Portuguese
Defesa Antioxidante
Diabetes gestacional
Estado Redox
Estresse Oxidativo
Progesterona
Abstract in Portuguese
O diabetes gestacional (DG) é uma condição definida como intolerância a carboidratos e hiperglicemia, com início no segundo trimestre da gravidez. Trabalhos desenvolvidos por nosso grupo mostraram que a progesterona (PG) é capaz de causar a morte de células pancreáticas, por um mecanismo dependente da geração de radicais livres, o que poderia contribuir para o desenvolvimento do DG. O objetivo desse trabalho foi estudar o efeito da PG, na presença ou não de antioxidantes, na expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo e na defesa oxidante em células pancreáticas da linhagem RINm5F. As células foram incubadas com PG 0,1, 1,0 e 100 µM por 6 ou 24 h, na presença ou não dos antioxidantes vitamina E e C. Após a incubação, foram realizados ensaios de viabilidade celular e fragmentação do DNA. A PG, não causou perda da integridade da membrana das células RINm5F, porém, ela promoveu fragmentação do DNA em, aproximadamente, 40% das células RINm5F e MCF-7 (controle positivo), enquanto que os antioxidantes vitamina E e C reduziram tal fragmentação. A partir da extração do RNA e síntese de cDNA foi investigada a expressão de 84 genes envolvidos no estresse oxidativo e defesa antioxidante. Dos 84 genes, cinco deles tiveram sua expressão aumentada em no mínimo, duas vezes em, pelo menos, duas concentrações diferentes, independentemente do tempo de incubação, ou nas mesmas concentrações em tempos diferentes, como os que codificam para a proteína de choque térmico a1a (Hspa1a), glutationa peroxidase 6 (Gpx6), dual oxidase 1 (Duox1), heme oxigenase 1(Hmox1) e estearoil-CoA desaturase 1 (Scd1). Esses genes, juntamente com a peroxirredoxina 4 (Prdx4), desempenham importante papel na fisiologia da célula pancreática e/ou DG. A expressão desses genes também foi estudada na pré-incubação das células RINm5F com as vitaminas E e C. Tais antioxidantes, de forma geral, foram capazes de aumentar a expressão de Hmox1 e Prdx4, genes com funções antioxidantes, e de diminuir de Scd1, um gene com função pró- oxidante. Ao nível citoplasmático, verificou-se que as quantidades das proteínas Hmox1 e Prdx4 também foram moduladas pela da PG e/ou vitamina E e C. Os resultados sugerem que esses antioxidantes apresentam importante papel na proteção da células RINm5F contra o dano oxidativo induzido pela PG. Desta forma, os resultados obtidos nesse projeto, em conjunto, devem colaborar para melhor compreensão da patogênese do DG, abrindo novas perspectivas não só para elucidação do mecanismo molecular envolvido na ação da PG sobre células pancreáticas e sua relação com o DG, mas para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento dessa doença baseadas na terapia com antioxidantes
Title in English
Progesterone effect on the genes expression involved on oxidative stress and antioxidant defense in pancreatic beta cells: an in vitro approach to the study of gestational diabetes
Keywords in English
Antioxidant Defense
Gestational Diabetes
Oxidative Stress
Progesterone
Redox State
Abstract in English
Gestational diabetes (GD) is a condition defined as carbohydrate intolerance and hyperglycemia, beginning in the second trimester of pregnancy. Studies developed by our group have shown that progesterone (PG) is able to cause pancreatic cells death, by a mechanism dependent on the generation of free radicals, which could contribute to the development of GD. The aim of this work was to study the effect of PG, in the presence or absence of antioxidants, on the expression of genes related to oxidative stress and oxidant defense in pancreatic cells of the RINm5F lineage. Cells were incubated with 0.1, 1.0 and 100 µM PG for 6 or 24 h, in the presence or absence of vitamin E and C antioxidants. PG did not cause loss of membrane integrity of RINm5F cells, however, it promoted DNA fragmentation in approximately 40% of the RINm5F and MCF-7 cells (positive control), whereas vitamin E and C antioxidants reduced such fragmentation. From the RNA extraction and cDNA synthesis was investigated the expression of 84 genes involved in oxidative stress and antioxidant defense. Among of 84 investigated genes, five of them had their expression increased, in the minimum 2-fold in, at least, two different concentrations independent of incubation time (6 or 24 h), or at the same concentrations at different times, such as those that encoding for heat shock protein a1a (Hspa1a), glutathione peroxidase 6 (Gpx6), dual oxidase 1 (Duox1), heme oxygenase 1 (Hmox1) and stearoyl-CoA denaturase 1 (Scd1). These genes, together with the peroxiredoxin 4 (Prdx4), play an important role in pancreatic cell physiology and/or DG. The gene expression was also studied in the preincubation of RINm5F cells with vitamin E and C. These antioxidants were generally able to increase the Hmox1 and Prdx4 expression, genes with antioxidant functions, and decrease the Scd1 expression, a gene with pro-oxidant function. At the cytoplasmic level, it was found that the amounts of Hmox1 and Prdx4 proteins were also modulated by PG and / or vitamin E and C. The results suggest that these antioxidants play an important role in the RINm5F protection cells against the oxidative damage induced by PG. Thus, the results obtained in this project, together, should contribute to a better understanding of the pathogenesis of DG, opening new perspectives not only to elucidate the molecular mechanism involved in the action of PG on pancreatic cells and its relationship with DG, but for the development of strategies for the prevention and treatment of this disease based on antioxidant therapy
 
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Publishing Date
2018-05-24
 
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