A pinta preta dos citros, causada por Phyllosticta citricarpa, possui dois tipos de inóculo: os ascósporos e os conídios. Os ascósporos são disseminados pelo vento e mais relacionados com a introdução da doença em novas áreas e os conídios disseminados por água, mais associados com o incremento da doença na copa das plantas. Apesar da importância dos ascósporos no ciclo da pinta preta, pesquisas com esse inóculo são escassas devido à dificuldade de produzi-los. Em 2017, um protocolo de produção de ascósporos in vitro por meio de cruzamentos de isolados de mating type compatíveis foi publicado. Assim, se tornou possível estudar os fatores que influenciam na produção e germinação de ambos os esporos. Esse estudo foi conduzido com o objetivo de: i) determinar a frequência dos dois mating type de isolados de P. citricarpa obtidos do parque citrícola paulista (SP); ii) quantificar a produção de ascósporos em diferentes meios de cultivo e temperaturas; iii) avaliar o efeito de diferentes temperaturas e períodos de molhamento sobre a germinação de conídios e iv) caracterizar sintomas de pinta preta em frutos de laranja doce inoculados com conídios e ascósporos. O mating type de 137 isolados de P. citricarpa obtidos de 1998 até 2021 foi identificado por meio da PCR duplex. A produção de ascósporos de cinco cruzamentos de MAT1-1 e MAT1-2 foi avaliada em meios de cultivo BDA, ½ BDA, extrato de malte ágar (EMA), aveia ágar e citros ágar. O meio BDA foi selecionado para avaliar a produção de ascósporos de três cruzamentos nas temperaturas de 10, 15, 20, 25 e 30°C. Os ascósporos foram quantificados semanalmente até 56 dias após os cruzamentos. A germinação de conídios foi avaliada em diferentes temperaturas (10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40°C) e períodos de molhamento (12, 24, 36 e 48 horas). Frutos de laranja Valência foram inoculados com 10³ conídios ou ascósporos e os sintomas de pinta preta foram caracterizados durante 360 dias. A proporção do MAT1-1 e MAT1-2 foi significativamente similar a 1:1 em SP. Ascósporos foram produzidos em meio BDA, ½ BDA e EMA, com pico de produção de 10⁴ ascósporos/mL no BDA e EMA até 21 dias. Os ascósporos foram produzidos nas temperaturas de 15°C, 20°C e 25°C, com picos de 10², 10³ e 10³ ascósporos/mL aos 42-49, 35 e 21 dias para as três temperaturas, respectivamente. A produção de ascósporos foi similar para todos os cruzamentos testados. O modelo beta-monomolecular foi ajustado aos dados de germinação de conídios em diferentes temperaturas e molhamentos. Os conídios germinaram de 9°C a 40°C com pico em 25°C e pelo menos 36 horas de molhamento. Os frutos inoculados com conídios e ascósporos apresentaram sintomas de falsa melanose e mancha dura. Esse estudo mostra que os ascósporos podem ser formados em todas as regiões de SP, a produção desses esporos pode ser afetada por diferentes fatores in vitro e eles são patogênicos em laranja e os resultados serão uteis para direcionar futuros trabalhos relacionados com epidemiologia e manejo da pinta preta com o uso dos dois tipos de inóculo do patógeno.

Citrus black spot (CBS), caused by Phyllosticta citricarpa, has two types of inoculum: ascospores and conidia. Ascospores are spread by wind and associated to the disease introduction in CBS-free areas, while conidia are spread by water and related to the increase of CBS in the tree canopy. Despite ascospore importance in CBS cycle, there are few studies with them due to the difficulty to produce ascospores. In 2017, a protocol was developed to produce ascospores in vitro through crosses among isolates from compatible mating type. Thus, factors that influence the production and germination of both spores may be studied. This study aimed to: i) determine both mating type frequency of P. citricarpa isolates obtained from São Paulo citrus belt (SP); ii) quantify ascospores production in different culture media and temperatures; iii) assess the effect of different temperatures and wetness periods on conidial germination, and iv) characterize CBS symptoms on sweet orange fruit inoculated with conidia and ascospores. The mating type of 137 P. citricarpa isolates obtained from 1998 to 2021 was identified through duplex PCR. Ascospores production was assessed in PDA, ½ PDA, malt extract agar (MEA), oatmeal agar and citrus agar culture media by using five crosses of MAT1-1 and MAT1-2 from different SP regions. PDA culture medium was selected to assess ascospore production at 10, 15, 20, 25 and 30°C temperatures by using three crosses. Ascospores were quantified weekly until 56 days after crosses. Conidial germination was assessed at different temperatures (10, 15, 20, 25, 30, 35 and 40°C) and wetness periods (12, 24, 36 and 48 hours). Valencia sweet orange fruit was inoculated with 10³ conidia or ascospore and CBS symptoms were characterized during 360 days. The proportion of MAT1-1 and MAT1-2 was significantly similar to 1:1 in SP. Ascospore production was observed in PDA, ½ PDA and malt extract agar, with a peak production of 10⁴ ascospores/mL in PDA and EMA until 21 days. Ascospores were produced in temperatures of 15°C, 20°C and 25°C, with peaks of 10², 10³ and 10³ ascospores/mL at 42-49, 35 and 21 days, respectively. Ascospore production was similar for all crosses. Betamonomolecular model was fitted to the conidial germination at different temperatures and wetness periods. Conidia germinated from 9°C to 40°C with a peak at 25°C and at least 36 h of wetness. Fruit inoculated with conidia or ascospore had false malanose and hard spot symptoms. This study shows that ascospore may be formed in all SP regions, production of these spores may be affected by different in vitro factors and they infect sweet orange fruit. The results will be useful for future research related to epidemiology and management of CBS with the use of both kind of P. citricarpa spores.