Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2003.tde-20102003-165028
Documento
Autor
Nome completo
Paulo Roberto Gagliardi
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2003
Orientador
Banca examinadora
Camargo, Luis Eduardo Aranha (Presidente)
Sluys, Marie Anne van
Vitorello, Claudia Barros Monteiro
Título em português
Análise estrutural e comparativa do genoma de Leifsonia xyli subsp. xyli.
Palavras-chave em português
bactéria gram-positivas
cana-de-açúcar
cromossomos vegetais
dna
genomas
mapeamento genético
microscopia eletrônica de varredura
raquitismo das soqueiras
variação genética em plantas.
Resumo em português
Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) é
agente causal de uma das mais importantes doenças da cana-de-açúcar: o raquitismo-da-soqueira
(Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). O presente trabalho teve como
objetivo principal usar métodos de análise cromossômica para corroborar o mapa
genômico da estirpe CTC B07 de L. xyli subsp. xyli obtido através do seqüenciamento
por "shotgun", realizado pelo grupo de seqüenciamento de Genomas Agronômicos e do
Meio-ambiente (AEG) da rede ONSA-FAPESP. A identidade do isolado foi confirmada
com a amplificação e seqüenciamento da região 23S do rRNA bem como por meio de
testes sorológicos de microaglutinação com antissoro específico. Além destes, foram
realizados testes de microscopia eletrônica de varredura da bactéria cultivada em meio
líquido para confirmar a pureza do isolado. O tamanho do genoma de L. xyli subsp. xyli
foi estimado com base na análise de fragmentos de restrição gerados por digestões com
as enzimas de restrição XbaI e SpeI e eletroforese de campo pulsado (PFGE). As
estimativas de 2.540 kb e 2.530 kb com XbaI e SpeI respectivamente ficaram próximas ao valor obtido pelo seqüenciamento genômico (2.596.959 pb). Em adição, o número de
seqüências repetidas e de genes ribossomais identificados pelo projeto genoma foram
confirmados por meio de hibridizações com sondas apropriadas. Comparações
genômicas de L. xyli subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis e duas espécies de Clavibacter
também foram objetivos deste trabalho. As comparações foram baseadas em análise de
RFLPs após a hibridização do DNA genômico utilizando como sondas elementos
genéticos móveis presentes no genoma de L. xyli subsp. xyli. As estimativas dos
números estimado de cópias destes elementos no genoma de L. xyli subsp. xyli obtidas
por hibridizações concordam com aquelas obtidas pelo seqüenciamento, considerando
fragmentos RFLPs menores que 9 kb. Informações referentes à fragmentos maiores não
foram obtidas uma vez que estes não foram adequadamente resolvidos na corrida
eletroforética. Finalmente, comparações através de análise de RFLP e rep-PCR
mostraram diferenças entre L. xyli subsp. xyli e L. xyli subsp. cynodontis bem como entre
estas e espécies de Clavibacter. Não foram verificadas diferenças entre a estirpe CTC
B07 de L. xyli subsp. xyli e a estirpe australiana.
Título em inglês
Structural and comparative analysis of the genome of leifsonia xyli subsp. xyli.
Palavras-chave em inglês
eletronic microscopic.
genetic diversity in plants
genetic mapping
gram-positive bactéria
ratoon stunting desease
sugarcane
vegetal cromossome
Resumo em inglês
Leifsonia xyli subsp. xyli (Davis et al.; 1984; Evtushenko et al.; 2000) is the
causal agent of one of the most economically important disease of sugarcane worldwide,
i.e, ratoon stunting disease (Gillaspie Jr. & Davis, 1992; Davis et al.; 1994). The main
objective of this study was to confirm the assembly of the genome of L. xyli subsp. xyli
obtained after shotgun sequencing by the Agronomic and Enviromental Genomes group
of the ONSA/FAPESP network. The identity of the strain was confirmed by
amplification and sequencing of the 23S rRNA region as well as by microaglutination
serological tests with specific antiserum. Besides this, scanning electron microscopic
analysis was used to assess the purity of the strain culture. The size of the genome of L.
xyli subsp. xyli was estimated based on restriction analysis after digestion of genomic
DNA with SpeI and XbaI followed by pulsed-field gel electrophoresis. The estimates of
2,530 kb and 2,540 kb, respectively for SpeI and XbaI, are in agreement with the one
obtained by whole genome sequencing (2,596 kb). In addition, the number of repeated
sequences and ribossomal genes predicted by thesequencing project was confirmed by hybridization experiments with the appropriate probes. Genomic comparisons of L. xyli
subsp. xyli, L. xyli subsp. cynodontis and two Clavibacter species comprised a second
objective of this study. Comparisons were based on RFLP analysis after hybridization of
digested genomic DNA using mobile genetic elements present in the genome of L. xyli
subsp. xyli as probes. The estimates of number of copies of these elements in the genome
of L. xyli subsp. xyli obtained by this approach agreed with the ones obtained by
sequencing if RFLP fragments smaller than 9 kb are considered. Data from larger
fragments were not obtained since they were not adequately resolved by electrophoresis.
Finally, RFLP and rep-PCR comparisons unveiled differences between L. xyli subsp.
xyli and L. xyli subsp. cynodontis as well as between these and Clavibacter. No
differences were found between strain CTC B07 of L. xyli subsp. xyli and an Australian
strain.
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Data de Publicação
2003-10-22