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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2019.tde-20191220-111545
Document
Author
Full name
Célia Regina Tremacoldi
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2001
Supervisor
Title in Portuguese
Inibidor de tripsina em Eucalyptus urophylla e seu efeito sobre o crescimento micelial in vitro de Pisolithus tinctorius e Rhizoctonia solani
Keywords in Portuguese
CRESCIMENTO IN VITRO
EUCALIPTO
FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
FUNGOS MICORRÍZICOS
INIBIDORES DE TRIPSINAS
TOMBAMENTO DE MUDAS
Abstract in Portuguese
Plantas, animais e microrganismos apresentam inibidores de proteases, os quais são proteínas que podem complexar-se com proteases de microrganismos e insetos herbívoros, inibindo sua capacidade proteolítica. Estes inibidores pertencem ao grupo de proteínas e enzimas que participam dos mecanismos de defesa das plantas, mas não há relatos quanto ao seu papel em interações simbióticas. Desta maneira, este trabalho teve por objetivos verificar a presença de inibidores de proteases em E. urophylla e sua influência sobre o crescimento micelial in vitro do fungo ectomicorrízico P. tinctorius isolado 1604 (compatível com E. urophylla) e isolado 185 (incompatível), e também do patógeno R. solani, causador de tombamento de mudas em viveiros de plantas. Para se atingir os objetivos propostos, os extratos protéicos brutos de sementes, raízes e folhas de E. urophylla foram incubados com BAPNA (α-benzoil- arginina-p-nitroanilida) e BTPNA (α-benzoil-tirosina-p-nitroanilida), substratos sintéticos cromogênicos para tripsina/papaína e para quimotripsina (Sigma) respectivamente, em presença de tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) para tripsina e quimotripsina e tampão acetato de sódio 0,2 M (pH 5,5) para papaína. Os resultados mostraram atividades de inibidores de tripsina e de papaína em sementes. A atividade de inibidor de tripsina também foi observada em raízes e folhas. A massa molecular do inibidor de tripsina de sementes, raízes e folhas foi estimada em cerca de 76 KDa, através de cromatografia líquida de exclusão molecular. O extrato bruto de sementes e frações do mesmo extrato, parcialmente purificadas por cromatografia de exclusão molecular, usando Sephacryl S-100-HR, com atividade de inibidor de tripsina, foram testados sobre o crescimento dos fungos. Os fungos foram cultivados em placas de Petri (5 cm de diâmetro), contendo 7 mL de meio BDA previamente adicionado de 0,21 e 47 µg de proteínas do extrato bruto ou de 0, 1, 3, 7, 15 e 20 µg de proteínas das frações. A concentração de proteínas foi estimada pelo método de Bradford, com albumina de soro bovino como padrão. As duas concentrações de proteínas do extrato bruto de sementes testadas e as concentrações superiores a 7 µg de proteína/placa das frações com atividade inibitória de tripsina apresentaram efeito fungistático sobre ambos os isolados de P. tinctorius, mas não alteraram o crescimento de R. solani. As proteínas da planta hospedeira com atividade de inibidor de tripsina apresentaram efeitos diferentes sobre o crescimento do fungo simbionte e do patogênico. Porém, a ausência de atividade de tripsina nos isolados de P. tinctorius e de R. solani, verificada através da incubação do meio de cultivo BD, onde cresceram previamente esses fungos, com o substrato BAPNA, não permitiu uma correlação direta da inibição do crescimento com a atividade do inibidor de tripsina de sementes.
Title in English
Trypsin inhibitor of Eucalyptus urophylla and its effect on in vitro mycelial growth of Pisolithus tinctorius and Rhizoctonia solani
Abstract in English
Plants, animals and microorganisms contain protease inhibitors, proteins which form complexes with microorganisms and herbivore insect proteases, causing inhibition of the proteolytic capacity. Inhibitors belongs to the group of proteins and enzymes which participate in the plant defense mechanisms, but no references to symbiotic interactions are reported. The objectives of the study were to verify the presence of protease inhibitors in E. urophylla and their effect on in vitro mycelial growth of the ectomycorrhizal fungus P. tinctorius, isolate 1604 (compatible with E. urophylla) and isolate 185 (incompatible), and on the plant pathogenic fungus R. solani, agent of damping-off in nursery plants. The crude protein extracts from seeds, roots and leaves of E. urophylla were incubated with BAPNA (α-benzoyl-arginyl-p-nitroanilide) and BTPNA (α-benzoyl-tyrosine-p-nitroanilide), synthetic chromogenic substrates for trypsin/papain and for chymotrypsin (Sigma), respectively, and with Tris-HCl buffer 0,1 M (pH 8,0) for trypsin and chymotrypsin or sodium acetate buffer 0,2 M (pH 5,5) for papain. The results showed activities of trypsin and papain inhibitors in seeds. It was also observed activity of trypsin inhibitor in roots and leaves. The molecular mass of the trypsin inhibitor from seeds, roots and leaves was estimated to be around 76 KDa, based upon molecular sieving chromatography. The crude protein extract from seeds and fractions partially purified by molecular sieving chromatography, using Sephacryl S-100-HR, with inhibitory activity against trypsin, were tested on fungal growth. The fungi were cultivated inside Petri dishes (5 cm diameter) containing 7 mL of PDA medium previously flooded with 0, 21 e 47 µg proteins from the crude extract or 0, 1, 3, 7, 15 e 20 µg proteins from the fractions. The protein concentration was estimated by the method of Bradford, using bovine serum albumin as standard. The two concentrations of proteins from seed crude extract tested and the concentrations higher than 7 µg protein/plate of the fractions with inhibitory activity against trypsin exhibited fungistatic effect on both isolares of P. tinctorius, but did not change the growth of R. solani. The trypsin inhibitor preparation of the host plant exhibited different effects on growth of the symbiont and pathogenic fungi. The lack of activity of trypsin by the P. tinctorius and R. solani isolates, determined by their growth on PD medium with BAPNA, did not allow to establish a direct correlation between the growth inhibition and the activity of the seed trypsin inhibitor.
 
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Publishing Date
2019-12-20
 
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