Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2006.tde-06042006-172002
Documento
Autor
Nome completo
Cristina Sayuri Maki
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2006
Orientador
Banca examinadora
Azevedo, Joao Lucio de (Presidente)
Kleiner, Aline Aparecida Pizzirani
Melo, Itamar Soares de
Mui, Tsai Siu
Pinheiro, José Baldin
Título em português
Diversidade e potencial biotecnológico de fungos endofÃticos de cacau (Theobroma cacao L.)
Palavras-chave em português
biodiversidade
cacau
fungo endofÃtico
Resumo em português
Endófitos são todos os microrganismos, cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, não causando danos ao hospedeiro e nem o desenvolvimento de estruturas externas, excluindo, dessa forma, bactérias noduladoras e micorrizas. Theobroma cacao L. é importante para as indústrias alimentÃcia e cosmética, por constituir a matéria prima para a produção de manteiga de cacau. Considerando a importância do estudo do cacaueiro e sua comunidade fúngica endofÃtica associada, os objetivos desse trabalho foram: i) estudar a
diversidade da comunidade endofÃtica de cacau; ii) avaliar o potencial dessa comunidade para o controle biológico de Crinipellis perniciosa, o agente causal da vassoura de bruxa e outros
fitopatógenos e iii) estudar a interação endófito-patógeno e endófito-hospedeiro. O trabalho foi iniciado com o isolamento de fungos endofÃticos de cacau, que foram caracterizados com base em caracterÃsticas morfológicas e moleculares. A diversidade foi avaliada por análises de rDNA (regiões ITS1, ITS2 e 5.8) (ARDRA e sequenciamento). A análise de ARDRA gerou 64
haplótipos, os quais incluÃram no mÃnimo, 16 espécies. A seguir, fungos endofÃticos antagônicos
de cacau foram selecionados in vitro contra C. perniciosa. Foi observado que, dentre os 145
isolados avaliados, 38.6% foram classificados como antagônicos, enquanto 13.1% foram classificados como parasitas. Após a seleção, os isolados foram usados para extração de metabólitos secundários e outras caracterizações. Também foi feita a detecção do gene da δ-(L-α- aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin (ACV), que é a precursora das β-lactanas, antibióticos como as
penicilinas e cefalosporinas. A amplificação desse gene gerou um fragmento de 600 pb em 9.1%
dos isolados avaliados. Alguns isolados foram testados contra fungos fitopatogênicos (Colletotrichum falcatum, C. sublineorum, Erythricium salmonicolor, Rhizoctonia solani,
Ceratocystis paradoxa, Phytophthora sp., P. parasitica, P. palmivora e Fusarium moniliforme).
Apenas C. sublineorum de sorgo e Ceratocystis paradoxa de cana-de-açúcar foram inibidos in
vitro pelos endófitos 42.3 e 2, respectivamente. Foi feita a investigação da habilidade de
penetração e colonização do fungo endofÃtico 42.3 em cacau comum suscetÃvel, usando as técnicas de RAPD e SEM. A penetração do fungo foi iniciada entre 3 e 6 horas após a inoculação. A interação entre o endófito de cacau 42.3 com C. perniciosa 281 (patogênico), foi avaliada por SDS-PAGE, visando a detecção de proteÃnas expressas pelo patógeno e pelo endófito. A SDSPAGE permitiu a visualização de bandas expressas na interação, quando os microrganismos foram crescidos juntos. Na presença do substrato de crescimento do endófito, C. perniciosa não expressou proteÃnas visÃveis, ou distinguÃveis em SDS-PAGE, mas o co-cultivo desses fungos, geraram bandas não observadas em análises prévias.
Título em inglês
Diversity and biotechnological potential of the cacao (Theobroma cacao L.) endophytic fungi
Palavras-chave em inglês
biodiversity
cacao
endophytic fungal
Resumo em inglês
Endophytes are all microorganisms, culturable or not, that inhabit the interior of plant
tissues, causing no harm to the host, and that do not develop external structures, excluding in this
way, nodulating bacteria and mycorrhizal fungi. Theobroma cacao L. is important to food and
cosmetic industry due the fact that it is used for production of cacao butter. Considering the
importance of cacao and associated endophytic fungal community studies, the objectives of this
work were to: i) study the diversity on endophytic community of cacao; ii) evaluate the potential
of this community to biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of witchesÂ’ broom disease and other phytopathogens and iii) study the interaction endophyte-pathogen and
endophyte-host. The work began with isolation of the cacao endophytic fungi that was characterizated based on morphological and molecelar characters. The diversity was evaluated by rDNA (ITS1, ITS2 e 5.8 subunit regions) analyses (ARDRA and sequencing). The ARDRA
analysis generated 64 haplotypes, which included at least 16 species. Following, antagonistic
endophytic fungi from cacao were selected in vitro against C. perniciosa. It was observed that in
145 evaluated isolates, 38.6% was classified as antagonic, while 13.1% were classified as
parasitic. After the selection, isolates were used for secondary metabolites extraction and further
characterization. Also, detection of δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin (ACV) gene, which is the precursor of β-lactans, antibiotics like penicilins and cephalosporins, was carried out. The amplification of this gene generated a fragment of 600pb in 9.1% of the isolates evaluated. Some isolates were further evaluated against phytophathogenic fungi (Colletotrichum falcatum, C. sublineorum, Erythricium salmonicolor, Rhizoctonia solani, Ceratocystis paradoxa, Phytophthora sp., P. parasitica, P. palmivora and Fusarium moniliforme). Only C. sublineorum of sorghum and
Ceratocystis paradoxa of sugarcane were in vitro inhibited by the endophytes 42.3 and 2, respectively. The investigation of the penetration and colonization ability of endophytic fungus
42.3 on susceptible cacao comum was carried out, using RAPD and SEM techniques. The penetration of the fungus was initiated between 3 and 6 hours after inoculation. The interaction between cacao endophyte 42.3 with C. perniciosa 281 (pathogenic), was evaluated by SDSPAGE, aiming the detection of expressed proteins by pathogen and endophyte. The SDS-PAGE allowed the visualization of bands expressed in the interaction, when the microorganisms were grown together. In the presence of the endophyte growth substrate, C. perniciosa do not express visible proteins or, at least, distinguishable in SDS-PAGE, but the co-cultive of these fungi generated non observed bands in previously analysis.
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Data de Publicação
2006-04-10