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Disertación de Maestría
DOI
10.11606/D.11.2010.tde-17092010-184903
Documento
Autor
Nombre completo
Luciano Rodolfo Ferreira de Lucena
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Piracicaba, 2010
Director
Tribunal
Vieira, Maria Lucia Carneiro (Presidente)
Gloria, Beatriz Appezzato da
Martins, Eliana Regina Forni
Título en portugués
Desenvolvimento in vitro e imunolocalização de 5-metilcitosina em raízes tuberizadas e não-tuberizadas de Viguiera arenaria Baker (Asteraceae)
Palabras clave en portugués
Cerrado
Citogenética vegetal
Citosina
Compositae - Regeneração - Técnicas in vitro
DNA
Germinação de sementes - Técnicas in vitro
Micropropagação
Raíz.
Resumen en portugués
Viguiera arenaria Baker é uma Asteraceae de Cerrado de porte herbáceo, filotaxia alterna, inflorescência em capítulo e que apresenta formação de raízes tuberosas. Apesar de análises fitoquímicas terem encontrado substâncias com atividades biológicas de interesse terapêutico, sabe-se pouco sobre a biologia da planta. Neste trabalho, buscou-se contribuir para o conhecimento de aspectos relacionados ao desenvolvimento de V. arenaria, visando atingir três objetivos específicos: verificar a taxa de germinação em condições in vitro; estabelecer um protocolo de regeneração in vitro; verificar modificações epigenéticas (metilação de citosina) no DNA de células cambiais de raízes tuberizadas e não-tuberizadas que possam estar associadas ao processo de tuberização. As sementes e raízes foram coletadas em área de Cerrado no Estado de São Paulo, Brasil, em duas épocas diferentes: em maio de 2008 (apenas sementes) e março de 2009 (sementes e raízes). Sementes e embriões de V. arenaria foram colocados para germinar, respectivamente, em papel filtro embebido com solução de nistatina e em meio de cultura sólido (MS com metade da concentração de macronutrientes), sendo mantidos em sala de crescimento (24°C e 16 horas/ luz) para avaliação do tempo e da porcentagem de germinação e embriões viáveis. No experimento de regeneração in vitro, folhas de plântulas, sete semanas após a germinação e segmentos hipocotiledonares, uma semana após a germinação, foram inoculados no mesmo meio, porém acrescido de diferentes concentrações de NAA (0,0; 0,01 e 0,05 mg.L-1), BAP (0,0; 0,2; 0,4 e 0,8 mg.L-1) e Zeatina (0,0; 0,2; 0,4 e 0,8 mg.L-1). Os explantes foram mantidos sob condições idênticas ao experimento de germinação. No estudo sobre imunolocalização de 5-metilcitosina, lâminas permanentes contendo cortes transversais de raízes tuberizadas e não-tuberizadas foram coradas com anticorpos fluorescentes contra 5-metilcitosina e contracoradas com DAPI. Foi observado um efeito de época de coleta de sementes, sendo aquela realizada em março de 2009 a que apresentou maiores porcentuais de embriões viáveis (72%) e de germinação de sementes e embriões (> 62% e 87%, respectivamente), embora o tempo de germinação tenha sido maior (~7 dias), comparativamente à coleta feita em maio de 2008 (~3 dias). Os experimentos de regeneração demonstraram certa recalcitrância da espécie na regeneração adventícia de brotos, pois os porcentuais de explantes com brotos foram inferiores a 25% na maioria dos tratamentos. Porém, houve 100% de formação de calos em diversos tratamentos. Por fim, verificaram-se mudanças no padrão de metilação e aumento de três vezes no conteúdo de DNA nas raízes tuberizadas relativamente às raízes não-tuberizadas.
Título en inglés
In vitro development and immunolocalization of 5-methylcytosine in tuberized and nontuberized roots of Viguiera arenaria Baker (Asteraceae)
Palabras clave en inglés
Cerrado
Citosine
Compositae-regeneration-In vitro techniques
DNA
Micropropagation
Plat cytogenetics
Root.
Seeds germination-In vitro techniques
Resumen en inglés
Viguiera arenaria Baker is an herbaceous Asteraceae from Cerrado presenting alternate phyllotaxis, capitulum inflorescence and tuberized roots. Although phytochemical analyses have found substances with biological activities of therapeutic interest, little is known about the biology of the plant. In this study, we sought to contribute to the knowledge of aspects related to the development of V. arenaria, aiming to achieve three specific goals: to determine the germination rate under in vitro conditions; to establish a protocol for in vitro regeneration; to check epigenetic modifications (cytosine methylation) in DNA of cambial cells in tuberized and non-tuberized roots, which may be associated with the tuberization process. The seeds and roots were collected in a Cerrado area in the State of Sao Paulo, Brazil, in two different times: in May 2008 (seeds only) and March 2009 (seeds and roots). Seeds and embryos of V. arenaria were placed to germinate, respectively, on filter paper soaked with a solution of nystatin and solid medium (MS with half-strength macronutrients), and maintained in a growth chamber (24 ° C and 16 hours/ light) to evaluate time for germination and percentages of germination and viable embryos. In the experiment of in vitro regeneration, leaves of seedlings, seven weeks after germination and hypocotyl segments, one week after germination were inoculated in the same medium supplemented with different concentrations of NAA (0, 0.01 and 0.05 mg.L-1), BAP (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 mg.L-1) and Zeatin (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 mg.L-1). Explants were kept under the same conditions of the germination experiment. In the study of immunolocalization of 5- methylcytosine, permanent slides containing transverse sections of tuberized and non-tuberized roots were stained with fluorescent antibodies against 5-methylcytosine and counterstained with DAPI. We observed an effect of harvest time, as the one held in March 2009 presented the highest percentage of viable embryos (72%) and germination of seeds and embryos (> 62% and 87% respectively), although the germination rate was higher (~7 days) compared to the harvest made in 2008 (~3 days). The in vitro assays showed some recalcitrance of the species in the regeneration of adventitious buds, as the percentage of explants with shoots were less than 25% in most treatments. However, there was 100% callus formation in different treatments. Finally, changes in the methylation pattern were observed as well as three-fold increase in DNA content in tuberized roots relatively to non-tuberized roots.
 
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Fecha de Publicación
2010-09-28
 
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