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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.11.2010.tde-19042010-164936
Document
Auteur
Nom complet
José Matheus Camargo Bonatto
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2010
Directeur
Jury
Labate, Carlos Alberto (Président)
Braga, Marcia Regina
Peres, Lazaro Eustaquio Pereira
Titre en portugais
Consequências da expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de Pisum sativum em plantas de Nicotiana tabacum: impactos no proteoma foliar, montagem dos fotossistemas e influência no desenvolvimento vegetal
Mots-clés en portugais
Cloroplastos
Ervilha
Expressão gênica
Fotossíntese
Fumo
Plantas transgênicas
Ritmo circadiano.
Resumé en portugais
O complexo coletor de luz (LHC) do fotossistema II (PSII) é o principal complexo de proteínas associado a pigmentos situado na membrana dos tilacóides de cloroplastos em plantas. O LHCII funciona como uma antena de transferência de energia para a captura e direcionamento da energia luminosa do PSII para o PSI. A ação coordenada dos dois fotossistemas com o direcionamento do fluxo de elétrons gera a quebra da molécula de água, através da membrana do tilacóide, produzindo força assimilatória ATP e NADPH. A energia química produzida na fotossíntese é de suma importância para a assimilação de carbono, biossíntese de aminoácidos e metabólicos secundários. Portanto, este é um importante gene para estudos em biotecnologia. Linhagens transgênicas de tabaco (TR-1 e TR-2) as quais expressam constitutivamente o transgene Lhcb1*2 de ervilha obtidas por Labate e colaboradores (2004) foram utilizadas nesse trabalho. Estas plantas apresentaram diversos efeitos pleiotrópicos relacionados à anatomia, morfologia, bioquímica e fisiologia. Uma proteína pode não atuar isoladamente, mas freqüentemente interagindo com outras proteínas, influenciando diversos processos metabólicos. O perfil de proteômica dessas linhagens transformantes, em relação à planta selvagem (WT) foi investigado. As proteínas totais foram extraídas de folhas de plantas de três meses crescidas em câmaras de crescimento, então separadas por 2D-PAGE. As proteínas diferencialmente expressas foram identificadas por LC-MS/MS. Os resultados mostram que 244 spots apresentaram alterações significativas na expressão nas duas linhagens transgênicas em relação à WT. 122 spots são expressos exclusivamente nas linhagens transformantes, e 24 spots somente na selvagem. Muitas proteínas como ATP synthase e ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase foram mais expressas nas linhagens transgênicas, mas a glutamine synthetase, uma importante proteína na reciclagem de nitrogênio nos cloroplastos, teve sua expressão diminuída. Para analisar as alterações na expressãode genes relacionados ao ritmo circadiano entre outros, como a conformação do PSII, cotilédones de plântulas estioladas foram submetidas à luz e amostras coletadas depois de 0, 3, 6, 12 e 24 horas. O nível de transcritos foram analisados por PCR quantitativo. A diferenciação de plastídio à cloroplasto maduro foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, para se entender as diferenças entre os genótipos em estudo no desenvolvimento vegetal. A expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de ervilha em plantas transgênicas de tabaco acarretou a indução e repressão de várias proteínas e genes em distintos passos de vias metabólicas, estabilizando a homeostase celular, exercendo uma influência significativa no desenvolvimento vegetal e produção de biomassa.
Titre en anglais
Consequences of constitutive expression og Lhcb1*2 gene of Pisum sativum in Nicotiana tabacum plants: Impact of leaves proteomics, assembly of photosystem and influence of plant development
Mots-clés en anglais
Chloroplasts
Circadian rhythms.
Gene expression
Pea
Photosynthesis
Tobacco
Transgenic plants
Resumé en anglais
The light harvesting complex (LHC) of photosystem II (PSII) is the major ensemble of pigmet-biding proteins situated in the thylakoid membranes of the chloroplast in plants. The LHCbII functions as an energy-transferring antenna for capturing and delivering light energy to the photosystems PSII and PSI. The coordinated actions of the two photosystems in turn drive the flow of electrons, generated by the splitting of water, through the thylakoid membranes to produce the assimilatory force ATP and NADPH. The chemical energy produced by photosynthesis is very important for the assimilation of carbon, amino acids biosynthesis, and secundary metabolism. Therefore it is an important gene for biotechnological studies. Transgenic tobacco lines (TR-1 and TR-2) which express the pea Lhcb1*2 transgene constitutively obtained by Labate et al. (2004) were used in this work. These plants presented pleiotropic effects related to anatomy, morphology, biochemistry and physiology. As a protein may not act by itself, but it is, frequently interacting with other proteins, influencing a lot of metabolic processes. The proteomic profile of these transgenic lines, in relation to the wild type (WT), was investigated. The total proteins extracted from leaves of three-month old plants grown in growth chambers were separated by 2DPAGE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. The results showed that 225 spots displayed significant changes in the expression of the two transgenic lines in relation to the WT. 122 spots were exclusively expressed in the transgenic lines, and 24 only in the wild type. Many proteins as ATP synthase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase are overexpressed in the transgenic lines, but the glutamine synthetase, an important protein tor nitrogen recycling in the chloroplasts, showed a reducted level of expression. In order to analyse the alterations of the expression of genes related to the circadian rhythm among others, involved in the conformation of the PSII, cotyledons from etiolated seedlings were thenexposed to light and samples collected after 0, 3, 6, 12 and 24 hours. The level of transcripts were analysed by RT/RT-PCR. The PSII conformation were analysed by transmition electron microscopy, with the aim of verifying the evolution of plastids into the chloroplasts which could be leading to changes in plant development. The overexpression of the pea Lhcb1*2 gene in transgenic tobacco plants, lead to the induction and suppression of several proteins and genes in key metabolic pathways, as a way to establish a cellular homeostasis, exerting a significant influence on plant development and biomass production.
 
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Jose_Bonatto.pdf (44.39 Mbytes)
Date de Publication
2010-04-27
 
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