Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2003.tde-20102003-161703
Documento
Autor
Nombre completo
Reinaldo Montrazi Barata
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Piracicaba, 2003
Director
Tribunal
Vieira, Maria Lucia Carneiro (Presidente)
Carrer, Helaine
Figueira, Antonio Vargas de Oliveira
Sluys, Marie Anne van
Vincentz, Michel Georges Albert
Título en portugués
Clonagem, caracterização da expressão gênica e do transporte intra-organelar da protease FtsH-p1 de tomate (Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom).
Palabras clave en portugués
citogenética vegetal
clonagem
enzimas
expressão gênica
melhoramento genético vegetal
proteínas
recombinação genética
tomate.
Resumen en portugués
A protease FtsH pertence à superfamília das proteínas AAA
(ATPases Associadas à diversas Atividades celulares) cujos membros estão
amplamente distribuídos entre procariotos e eucariotos. Nas plantas superiores,
elas são codificadas por genes nucleares e sintetizadas por ribossomos
citosólicos com uma seqüência de direcionamento na extremidade amino-terminal
responsável pela translocação da pré-proteína para o interior das
organelas, notadamente mitocôndrias e cloroplastos. Com o objetivo de
caracterizar o processo de translocação da proteína aos tilacóides e sua
regulação gênica em plantas, isolou-se um cDNA de frutos de tomate
(Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom), cuja seqüência de aminoácidos
revela a presença de todos os motivos clássicos pertencentes a uma protease
do tipo FtsH-p1. A caracterização inicial da proteína indicou a presença de um
típico peptídeo de trânsito cloroplástico em sua extremidade amino-terminal. A
fim de definir qual região da proteína madura está envolvida no direcionamento
da protease às membranas, foram realizadas construções gênicas contendo diferentes comprimentos da região amino-terminal da FtsH-p1 de tomate
fusionados ao gene repórter GFP (green fluorescent protein). Estudos
realizados a partir de frações enriquecidas de cloroplastos, estroma e tilacóide,
provenientes de plantas transgênicas expressando estavelmente estas
construções, revelaram que todas as proteínas de fusão acumularam-se no
estroma sendo, portanto incapazes de associarem-se aos tilacóides. Estes
dados indicam que a inserção da FtsH-p1 de tomate nas membranas dos
tilacóides dependem de informação presente na proteína madura, necessária
para a interação com as membranas ou mesmo com um fator adicional
desconhecido. Alem disso, foi mostrado que membros da família das proteases
do tipo das FtsHs em plantas não apresentam o clássico motivo RRXFLK,
previamente descrito como essencial para a translocação dependente de uma
dupla arginina (Tat). Devido ao envolvimento de ortólogos desta proteína em
processos fisiológicos importantes nas plantas, abriu-se a possibilidade de
estudar a regulação da FtsH-p1 de tomate via clonagem e caracterização da
sua região promotora. Uma vez clonada, 4 deleções à partir da extremidade 5
nesta região foram realizadas e fusionadas de forma a dirigirem a expressão do
gene repórter uidA (GUS). Estas construções foram expressas estavelmente
em plantas de tabaco, a fim de estudar sua regulação em diferentes tecidos,
estádios de desenvolvimento e em resposta a estímulos ambientais ou
situações de estresse. Os resultados preliminares mostraram que a seqüência
regulatória clonada é responsível tanto à fatores ambientais, como luz, quanto
aos hormônios auxina, citocinina e giberelina. Além disso, foi observada uma
regulação negativa na presença de peróxido de hidrogênio. Entretanto,
tratamentos envolvendo estresse salino, bem como variações na temperatura
não geram nenhum efeito na atividade da enzima GUS. O mesmo ocorre
quando as plantas são colocadas em presença de ácido abscísico (ABA). Os
resultados deste estudo contribuem significativamente para um melhor
entendimento dos mecanismos de regulação envolvidos no controle da expressão gênica da FtsH-p1 de tomate, bem como sugerem novas
perspectivas no direcionamento de proteínas às membranas.
Título en inglés
Molecular cloning, characterization of the gene expression and intra-organellar transport of tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Microtom).
Palabras clave en inglés
cloning
enzymes
gene expression
gene recombination
plant breeding
plant cytogenetic
proteins
tomato.
Resumen en inglés
The FtsH protease belongs to the AAA family (ATPases associated
with different cellular activities) whose members are widely distributed in
prokaryotes and eukaryotes. In higher plants, these proteins are nuclear-encoded
and synthesized by cytosolic ribosomes as larger molecular weight
precursors. These molecules carry at the N-terminal extension a specific
targeting sequence that directs translocation of the preproteins to the envelope
membranes of mitochondria and chloroplasts. In the present work, a tomato
(Lycopersicon esculentum Mill. cv. MicroTom) fruit cDNA encoding a plastid
FtsH-p1 has been isolated, cloned and characterized. In order to define the
protein domains involved on thylakoid targeting, several gene constructions
were prepared carrying increasing lengths of the N-terminal region of tomato
FtsH fused to the gfp (green fluorescent protein) reporter gene. In vivo
expression studies based on onion cells or stable expression in transgenic
tobacco plants showed that the chimeric proteins were translocated to plastids. In addition, sub-organellar fractionation indicated that GFP accumulated in the
stromal fraction, instead of being translocated to the thylakoid membrane. These
data suggest that membrane insertion of tomato FtsH-p1 requires information
present in the mature protein. One remarkable finding was that members of the
FtsH family do not present the classical RRXFLK motif, that has been shown to
be essential for the Tat-dependent pathway. The FtsH-family members are
involved in important physiological processes in plant cells. Therefore, this study
opened up the possibility of studying the FtsH-p1 gene regulation by
characterization of its regulatory region. After cloning a 1700 bp fragment
corresponding to 5 upstream region of the tomato FtsH coding sequence, four
deletions of the promoter region were performed and the resulting fragments
were fused to the uidA (GUS) reporter gene. These gene constructs were stable
expressed in tobacco plants and further characterized. The results showed that
the promoter region is positively regulated by light and the phytohormones
auxin, cytokine and gibberelin. Besides, the promoter was down regulated by
hydrogen peroxide. However, GUS activity was not affected by salt stress,
variations on the temperature and abcisic acid treatment. The results presented
here expand the current understanding of factors involved on FtsH gene
regulation as well as bring new insights on the protein targeting to membranes.
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Fecha de Publicación
2003-11-04