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Mémoire de Maîtrise
DOI
Document
Auteur
Nom complet
Adriana Cristina Alves
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 1999
Directeur
Titre en portugais
Estudos anatômicos da organogênese in vitro de soja e otimização do processo de transformação via Agrobacterium tumefaciens
Mots-clés en portugais
ANATOMIA VEGETAL
ORGANOGÊNESE IN VITRO
PLANTAS TRANSGÊNICAS
SOJA
TRANSFORMACAO GENÉTICA
Resumé en portugais
Com o objetivo de se determinar os tipos celulares capazes de originar gemas adventícias em soja [Glycine max (L.) Merrill], assim como a localização das áreas meristemáticas, estudou-se o processo de diferenciação in vitro através de análises anatômicas. Utilizando-se como explantes nós cotiledonares, excisados aos 14 dias após a germinação in vitro, foi observado que as áreas meristemáticas localizadas na superfície do explante são formadas pela rediferenciação de células da epiderme e das primeiras camadas do parênquima cortical, caracterizando sua origem exógena, sendo que as gemas adventícias formam-se diretamente sobre o tecido do explante. A utilização de BAP durante a germinação das sementes foi um pré-condicionamento para a formação das gemas. Neste estudo, também foram realizados ensaios para a otimização do processo de transformação via Agrobacterium. O emprego de ferimentos durante a inoculação da bactéria, visando alcançar células no interior do explante, não é necessário, uma vez que as células meristemáticas estão localizadas superficialmente e em processo ativo de divisão desde o início da cultura, fator importante na transformação genética. Doze variáveis foram avaliadas: adição e concentração de acetoseringona em meio de cultura e na cultura bacteriana, pH, temperatura, tempo de co-cultivo, meio de inoculação, concentração de células bacterianas, co-cultivo e pré-cultivo do explante na presença de 6-benzilaminopurina, linhagens bacterianas e ferimento no explante, totalizando 22 tratamentos. Os caracteres estudados foram número de explantes apresentando reação positiva para o teste GUS e número de pontos azuis. Os dados foram analisados segundo o teste estatístico de X2. Nenhum dos tratamentos apresentou mais do que 10% de explantes GUS positivos. Na maior parte dos tratamentos, 100% dos pontos azuis foram encontrados em regiões não meristemáticas, como epicótilos, cotilédones e base dos cotilédones. Em experimentos posteriores observou-se que o Agrobacterium comporta-se de maneira diferenciada conforme a combinação de pH e temperatura. Todas as combinações (linhagens AGLl, EHAI05 e GV2260; pH 5,0 e 5,8; temperaturas 25 e 28°C) foram acompanhadas de aumento na expressão do gene repórter em áreas meristemáticas. A localização histológica do produto da expressão do gene repórter uidA mostrou que esta ocorre em células da epiderme e do parênquima cortical, sendo estes os mesmos tipos celulares envolvidos na formação das gemas adventícias em nós cotiledonares de soja. Esta coincidência suporta a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de soja, utilizando-se como vetor o Agrobacterium tumefaciens.

Titre en anglais
Anatomical studies of in vitro soybean [Glycine max (L.) Merrill] organogenesis and optimization of the transformation process media ted by Agrobacterium tumefaciens.

Resumé en anglais
In order to determine the cells types capable to give rise to soybean [Glicine max (L.) Merrill] adventicious buds, as well as the localization of meristematic areas, the in vitro differentiation process was studied through anatomical analysis. Using explants derived from cotyledonary nodes excised 14 days after in vitro germination, we observed that the localization of meristematic areas is superficial and they are formed by the dedifferentiation of epiderm and the first layers of cortex parenchymatous cells, characterizing their exogen origin and direct formation without a callus phase. Utilization of BAP during seed germination was a precondition to bud formation. As a second objective the optimization of transformation process was carried out. The employment of injury during Agrobacterium inoculation, aiming to reach cells inside the explants is not necessary, because meristematic cells are superficially localized and in active division process since the begining of in vitro culture, the most important factor for genetic transformation. In this study, optimization assays to Agrobacterium transformation were accomplished, where 12 variables were tested, such as addition and acetosyringone concentrations on culture and/or bacteria media, bacterium cells concentration, cocultivation and precultivation with hormone 6-benzilaminopurine, temperature, pH, length of cocultivation, inoculation medium, bacterium strains and explant injury, totalizing 22 treatments. The experiment analysis was based on the number of GUS positive explants and on the number of blue spots. Data were analysed according to the x2statistical procedure. None of the treatments presented more than 10% of GUS positive explants. For most of the treatments, 100% of blue spots were found in non-meristematic regions, such as epicotyl, cotyledons and cotyledon bases. Posterior experiments showed that Agrobacterium behaviour differs according to pH and temperature combinations. All combinations (strains AGL1, EHA105 and GV2260; pH 5.0 and 5.8; temperatures 25 and 28°C) were responsabIe for an increase in the expression of the reporter gene in meristematic areas. The hystoIogic Iocalization of the product of the expression reporter gene uidA took place in epiderm and cortex parenchymatous cells, the same cell types involved in adventicious bud formation in soybean cotyIedonary nodes. This juxtaposition exposes the possibility of acquisition of soybean transgenic pIants employing Agrobacterium tumefaciens as vector.
 
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Date de Publication
2019-11-08
 
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