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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-112833
Documento
Autor
Nome completo
Adriana Cristina Longo
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 1991
Orientador
Título em português
Clonagem e caracterização do gene de resistência a nistatina em Saccharomyces cerevisiae
Palavras-chave em português
ANTIBIÓTICOS
CLONAGEM
LEVEDURAS
RESISTÊNCIA GENÉTICA
Resumo em português
O presente trabalho descreve a clonagem do gene de resistência a nistatina, num plasmídio replicativo bifuncional (YRp7) e sua utilização como marcador seletivo dominante na transformação de Saccharomyces cerevisiae. Vinte e um transformantes foram selecionados diretamente em meio de YEPD acrescido de 60 ug/ml de nistatina, após 3 dias de incubação a 30°C. O DNA gnômico dos clones foi extraído e utilizado para transformar E. Coli a fim de recuperar e amplificar os plasmídios recombinantes. Quatro diferentes plasmídios foram isolados e seus pesos moleculares estimados. Verificou-se que três deles não apresentavam os padrões eletroforéticos esperados. Provavelmente, por alterações estruturais ocorridas durante o processo de transformação. Uma nova transformação, com DNA purificado dos quatro plasmídios, foi realizada a fim de confirmar a clonagem. A retransformação em E. coli com DNA total recuperou os mesmos plasmídios. Outras linhagens de S. cerevisiae foram transformadas e foi possível observar que mesmo entre linhagens há uma considerável diferença quanto as suas capacidades de receber, manter e expressar DNA exógeno, pois foi grande a variação nas suas eficiências de transformação. A instabilidade mitótica dos clones quando crescidos em meio não seletivo mostrou que os plasmídios se replicam autonomamente nas células, e que ha uma variação nos seus números de cópias, pois ao testar o nível de resistência dos clones à nistatina, evidenciou-se que eles variam desde 60 ug/ml, para os plasmídios pNYS1 e pNYS3, ate 210 ug/ml para pNYS2 e pNYS4. Os resultados obtidos sugerem que os genes de resistência à nistatina constitui-se num marcador seletivo em potencial para a construção de vetores plasmidiais. Estudos futuros visarão a caracterização, localização e subclonagem, além dos efeitos da resistência à nistatina nas células.
Título em inglês
Clonagem e caracterização do gene de resistência a nistatina em Saccharomyces cerevisiae
Resumo em inglês
Cloning and characterisation of nystatin resistance gene in Saccharomyces cerevisiae The present work describes the cloning of nystatin dominant resistance gene, in a bifunctional replicating plasmid (YRp7) and its use as a selective marker in the transformation of Saccharomyces cerevisiae Twenty- one resistant transformants were directly selected in YEPD medium containing 60 ug/ml of nystatin, after 3 days of incubation at 30°C. The genomic DNA of the clones was isolated and utilized to transform E. coli in order to amplifye and rescue the plasmids. Four diferents plasmids were isolated and their molecular weights determined. It was possible to verify that three of them had not the standard electrophoretyc patterns. Possibly due to structural alterations occurred during the transformation process. A new transformation with the purified DNA was realized to confirm the gene cloning. The retransformation in E. coli, with total DNA of the four plasmids, rescued the same plasmids. Other S. cerevisiae strains were transformed and it was possible to observe that even among strains there is a difference in their capacities to receive, mantain and express the foreign DNA once there was a variation in their transformation efficiencies. The mitotic instability of the clones, when grown in non- selective medium showed that the plasmids replicate autonomously into the cells. And probably, there is a difference in their copy numbers, once in order to test the resistance level of the clones, it was verified that they vary from 60 ug/ml to pNYS1 and pNYS3 plasmids, to 210 ug/ml to pNYS2 and pNYS4 plasmids. The results obtained support that the nystatin gene resistance is a potencial marker to be used in plasmid vector construction. Future studies suggest the final characterisation of the gene, subcloning, location and studies related with the effect of nystatin resistance into the cells.
 
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Data de Publicação
2019-12-19
 
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