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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-125134
Documento
Autor
Nome completo
Gonçalo Amarante Guimarães Pereira
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 1989
Orientador
Título em português
Atividade inulinolítica extracelular em Kluyueromyces marxianus
Palavras-chave em português
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
ELETROFORESE
FUNGOS
HIDRÓLISE
INULINASE
LEVEDURAS
Resumo em português
O presente trabalho teve como principal objetivo caracterizar a atividade inulinolítica de K. marxianus. Para isso foram conduzidos experimentos em linhagens com propriedades contrastantes, tendo sido identificada e caracterizada a enzima envolvida, e determinadas as fontes de modulação do sistema. A análise eletroforética do sobrenadante das culturas permitiu a identificação da banda relativa a inulinase, sendo constatado a existência de apenas uma enzima no sistema. Essa enzima possui peso molecular aparente de 94 Kd, e a estrutura de sua banda indica a existência de glicosilação. Em cultura, a enzima apresentou-se estável por pelo menos 48 h, com a maior parte da produção pelas células ocorrendo na fase estacionária. A temperatura ótima de atividade situa-se entre 30 e 40°C, havendo forte inativação após os 50°C, e inativação total a partir dos 60°C. Quanto ao pH, a enzima apresenta atividade hidrolítica entre 2,5 e 8,0, porém o seu pico situa-se em 6,5, sendo observado variações bem acentuadas nas proximidades desse ponto. Células inteiras apresentam a capacidade de hidrolisar inulina, e por autólise com clorofórmio e tolueno foi possível isolar a enzima da parede, tendo essa apresentado o mesmo padrão eletroforético da extracelular. Devido a fragilidade da parede de K. marxianus, chegou-se a conclusão de que a atividade extracelular é consequência de pequena capacidade do envoltório de reter as proteínas no espaço periplasmálico, não havendo um sistema específico para a exportação ao meio de cultura. Variações na atividade inulinolítica foram observadas quando diferentes fontes de nitrogênio foram avaliadas. Nos diferentes ensaios foi demonstrado que na ausência de extrato de levedura, peptona ou uréia não ocorre atividade extracelular. Em linhagens apresentando repressão catabólica, foi verificado que só ocorre atividade extracelular na presença de inulina. Carboidratos relacionados, como a sacarose, não substituem o polímero para esse efeito. Comparando-se os sistemas Killer e inulinase, verificou-se que em condições de aumento da exportação da toxina Killer, há uma consequente redução da atividade inulinolítica específica. A explicação para tal fato pode estar na competição das duas enzimas pelo sistema celular de secreção. A nível genético, foi constatado que, à semelhança do que é verificado para linhagens de K. lactis em relação ao sistema da lactose, para a inulinase de K. marxianus muitas linhagens de ocorrência natural não apresentam repressão por glicose. Da análise dos híbridos entre linhagens desreprimidas, parcialmente desreprimidas e reprimidas, chegou-se à conclusão da existência de ao menos dois elementos transnegativos atuando no sistema. A linhagem IZ 619, apresentando grande atividade inulinolítica extracelular, foi avaliada para a exportação de proteína. Em meio complexo, após 4 dias em cultura a linhagem apresentou, em comparação com uma linhagem industrial de S. cerevisiae, um excedente na produção de 270 mg/l. Considerando-se que cerca de 90% da proteína exportada foi identificada como inulinase, conclui-se pela propriedade do uso de um sistema como esse na produção de peptídeos heterológos.
Título em inglês
Extracelular inulinolytic activity of Kluyveromyces marxianus
Resumo em inglês
This study was undertaken to characterize of the inulinolytic activity of K. marxianus Strains of contrasting properties were used to determine the factors affecting the enzyme activity. Using eIetrophoretic anaIysis it was determined the presence of only one enzyme, with apparent molecular weight of 94 Kd. The band pattern indicates the possibility of the enzyme to be glicosilated. When the cells were grown in a liquid medium, the inulinase activity was detected specially toward the end of the log phase and during the stationary phase. The enzyme showed stability for at least 48 h in culture. The optimal temperature to hydrolysis is in the range of 30 e 40°C, with a sharp decrease of activity at 50°C, and total inactivation after 50°C. Enzyme activity is performed in the range of 2.5 to 8.0 pH being the optimum point at pH 6.5. Intact cells show ability to hidrolise inulin, and by autolysis with chloroform and toluene it was possible to isolate the wall enzyme, that presents the same eletrophoretic pattern or the extracellular enzyme. The fragileness of the cell wall, associated to the high production of the proteins was thought to be the cause of the extracellular activity. The data indicate the absense of any transport system across the cell wall to release the inulinase in the culture medium. Variation in inulinotytic activity was observed when different nitrogen source were evaluated. When the cells were grown in a liquid medium without urea, peptone or yeast extract, no extracellular activity was detected. In repressible strains, besides the nitrogen source the presence of inulin is necessary to increase inulinase production and to occur the enzyme release into the culture medium. Comparing the Killer system with the inulinase system. It was found a condition that increases the exportation of the Killer toxin, causing a concomitant decrease of the specific inulinolytic activity. This fact might indicate a competition between two enzymes for the secretory process. Analogously to the lactose system or K. lactis, there are in K. marxianus several derepressed strains of natural occurrence. The genetic analysis of the hybrids between no-repressed, semi-repressed and repressed strains determined the existence of at least two transnegative elements operating in the system. The strain IZ 619, of high extracellular inulinolytic activity, compared to Saccharomyces cerevisiae, industrial strain (Fleischman) produced a relative excess of 270 mg/l of protein after four days growing in complex medium. About 90% of this protein was found to be inulinase which indicates a strong ability of this protein export. In view of this result it might be appropriate to use K. marxianus as heterologous protein producer, specially through the inulinase system.
 
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Data de Publicação
2019-12-19
 
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