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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-153449
Document
Auteur
Nom complet
Maria Bernadete Silvarolla
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 1990
Directeur
Titre en portugais
Análise citológica de calos e plantas regeneradas in vitro de variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp)
Mots-clés en portugais
CALOS
CANA-DE-AÇÚCAR
CITOGENÉTICA VEGETAL
REGENERAÇÃO IN VITRO
VARIEDADES VEGETAIS
Resumé en portugais
As variedades de cana-de-açúcar em cultivo, caracterizam-se por apresentarem cromossomos pequenos e em número elevado. Estas características dificultam a determinação segura do número de cromossomos das variedades, sendo comuns referências a mosaicismo cromossômico. Dessa maneira, torna-se necessário estabelecer metodologias específicas para a obtenção das preparações e critérios para sua avaliação, de modo a se distinguir a variação real daquela devida a erros de interpretação. Neste estudo analisaram-se plantas regeneradas in vitro quanto ao número de cromossomos, comparativamente às respectivas variedades doadoras, que também foram avaliadas acerca de sua estabilidade cromossômica. Foram testadas metodologias para a obtenção de preparações onde os cromossomos metafásicos estivessem nítidos, dispersos e contidos em células intactas, baseadas na utilização de pré-tratamentos com inibidores do fuso mitótico e de síntese proteica, isolados ou combinados, bem como no emprego de maceração enzimática. Além das distribuições de frequências de contagens dos números de cromossomos, foi estabelecido ainda, um critério para a seleção das metáfases segundo sua qualidade, de modo a se obter uma avaliação confiável do número de cromossomos. Deste modo verificou-se que as variedades doadoras, POJ2878, NA56-79, Co4l9, IAC68-l2 e IAC68-l44, nas condições do presente estudo, não apresentaram mosaicismo cromossômico, tendo respectivamente, 118, 114, 113, 112 e 115 cromossomos. Os subclones analisados citologicamente foram obtidos pela regeneração de calos obtidos a partir de dois tipos de explantes, cultivados por períodos variáveis, em meios de cultura sólidos contendo 2,4-D. Entre os quatorze subclones analisados quanto ao número de cromossomos, treze apresentaram as maiores frequências de metáfases de melhor qualidade coincidentes com o número de cromossomos obtido por sua respectiva variedade doadora, não se detectando variação quanto ao parâmetro avaliado. Apenas um subclone, derivado da variedade NA56-79, aparentou ser portador de certa instabilidade cromossômica. Os agentes de pré-tratamento testados para as doadoras e maioria dos subclones, somente se mostraram eficientes na obtenção de metáfases com cromossomos dispersos e nítidos, quando utilizados de forma a conjugar a ação do inibidor de síntese proteica, cicloheximida e um dos inibidores de fuso, 8-hidroxiquinolina ou 1-bromonaftaleno. Para a obtenção de metáfases contidas em células intactas teve fundamental importância a maceração enzimática. Na tentativa de se dispor de um marcador citológico auxiliar na identificação de variantes somaclonais foram testadas duas metodologias de bandamento NOR nas variedades NA56-79, IAC68-12 e IAC68-144. Verificou-se que, apesar de um dos métodos ter produzido bandas NOR, a qualidade das metáfases não foi satisfatória indicando a necessidade de adequações para se obter um padrão nítido de bandas NOR em cana-de-açúcar. Assim, foi possível somente a avaliação preliminar do número de nucleólos presentes em núcleos interfásicos, a qual indicou 1 a 9 nucléolos por célula. Visando futuras análises citológicas na fase de calo, realizou-se o estudo histológico de calos de diferentes subculturas em presença de 2,4-D e também uma observação da fase de regeneração (6-BA). No que se refere aos calos mantidos em 2,4-D verificou-se que a proliferação celular que resultou na formação dos calos ocorreu a nível dos feixes vasculares, compondo-se de células de aspecto meristemático com alto índice mitótico. Estas regiões situavam-se mais internamente no calo até aproximadamente 6 meses de cultura, sugerindo amostragens internas para a obtenção de maior número de divisões. Posteriormente, as regiões mais internas passaram a ser constituídas de células onde não se observaram divisões celulares, resultando então, numa inversão das regiões de coleta, que seriam mais externas, onde ocorreram células com aspecto meristemático e/ou parenquimático. Quanto aos calos em meio de regeneração não foi possível definir claramente as regiões ideais de coleta nem ainda se a morfogênese se processava via organogênese ou embriogênese somática, embora os calos evidenciassem potencial morfogenético
Titre en anglais
Cytological analysis of callus and plants regenerated in vitro from sugarcane varieties (Saccharum spp)
Resumé en anglais
Sugarcane varieties cultivated nowadays are characterized by presenting high number of small chromosomes. These characteristics difficult the consistent determination of chromosome number of the varieties and many cases of chromosome mosaicism have been reported in the literature. Therefore, it becomes necessary to establish proper methodologies for slides preparation and evaluation criteria to distinguish the real variation from those due to interpretation errors. The present study aimed to analyse the chromosome number of plants regenerated in vitro comparatively to their respective donnor varieties, that were also evaluated for their chromosomic stability. It was tested methods to obtain preparations with distinct, spread and intact metaphase figures, based on the use of pre-treatments with mitotic spindle and proteic synthesis inhibitors, isolately or combined, and on the use of enzimatic maceration. Beyond the distribution of counting frequencies of chromosome number, it was also established a criterion to select the metaphases according to their quality, in order to obtain a secure evaluation of chromosome number. In the present study conditions, the donnor varieties POJ2878, NA56-79, Co419, IAC68-12 and IAC68-144 , showed no chromosomic mosaicism comprising 118, 114, 113,112 and 115 chromosomes, respectively. The subclones cytologically evaluated were obtained by regeneration of calli that were induced and maintained during variable periods on solid medium in presence of 2,4-D. Among 14 suclones analised for chromosome number, 13 showed the higher frequencies of metaphases of the best quality, coincident with the chromosome number verified for its respective donnor variety, not presenting, therefore, variation on the evaluated parameter. Only one subclone, derived from NA56-79, showed some instability related to chromosome number. To the donnor and most of sublones, the pretreatments agents tried were efficient to obtain metaphases with disperse and distinct chromosomes when utilized conjungating the action of the inhibitor of proteic synthesis, cycloheximide and one of the spindle inhibitors, 8-hydroxiquinoline or 1-bromonaftalene. Enzimatic maceration was of fundamental importance to obtain intact metaphases figures. It was also tested two methods of NOR banding with the varieties NA56-79, IAC68-12 and IAC68-144, as an auxiliary cytological marker in the identification of somaclonal variants. In spite of one of the methods had produced NOR banding marks, it was verified that, the quality of the metaphases was not satisfactory, indicating a need for adaptations to obtain a clear pattern of NOR banding in sugarcane. So, it was only possible a preliminar evaluation of the number of nucleoli present in the interphasic nuclei, indicating the occurrence of 1 to 9 nucleoli per cell. As an aid to the cytological analysis in the callus stage, a histological study of the calli in different subcultures in presence of 2,4-D was carried out, including an observation during the regeneration stage (6-BA), as well. Regarding to the calli maintained in 2,4-D in was found that the cellular proliferation resulting in callus formation originated from the vascular bundles and was composed of meristematic-like cells, with high mitotic index. Those regions were located inside the callus mass until approximately 6 months of culture, suggesting that internal samples should be taken in order to obtain a major number of divisions. Later it was observed that the most inner regions were composed of cells where it was not observed cellular divisions resulting therefore in an inversion of the regions to be sampled, which should be more external where it was observed the presence of meristematic and/or parenchymatic-like cells. With reference to calli on regeneration medium it was not possible to define the ideal regions to collect samples in order to proceed a cytological analysis, nor define if the morphogenesis occurred via organogenesis of somatic embryogenesis, although the calli had showed morphogenetical potential
 
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Date de Publication
2019-12-19
 
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