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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-180659
Documento
Autor
Nome completo
Francisco Cláudio da Conceição Lopes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2002
Orientador
Título em português
Caracterização da atividade proteinásica digestiva de Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae) e sua sensibilidade à chagasina
Palavras-chave em português
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
GORGULHO-DA-CANA-DE-AÇÚCAR
INIBIDORES DE PROTEINASES
PLANTAS TRANSGÊNICAS
Resumo em português
Inibidores de proteinase têm sido amplamente utilizados na transformação de plantas visando o controle de insetos-praga. Neste trabalho nós realizamos um detalhado estudo de identificação das atividades proteolíticas presentes no intestino de larvas de Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae), uma importante praga da cana-de-açúcar. Foi verificado uma atividade majoritária de cisteíno proteinases (CP's), juntamente com uma atividade menor de serino proteinases. Esses dados nos levaram a transformar cana-de-açúcar com um novo inibidor de cisteíno proteinases denominado Chagasina. Esta proteína foi isolada em Trypanosoma cruzi e sua caracterização bioquímica revelou que ela é um inibidor de cisteíno proteases. Isto foi confirmado através de ensaios enzimáticos com a forma recombinante da proteína que exibiu potente atividade inibitória sobre as CPs presente nos tubos digestivos de S. levis. Construções gênicas contendo o gene Cha e o gene repórter NPTII foram utilizadas para transformação de calos embriogênicos de cana-de- açúcar via biobalística. Plantas selecionadas em meio contendo Geneticina foram submetidas a análises moleculares através de PCR, RT-PCR e Western Blotting que revelaram a integração e expressão do transgene em vários transformantes. Ensaios com extratos de plantas transgênias foram realizados com o objetivo de avaliar um provável efeito da Chagasina expressa em inibir as CPs de S. levis. Apesar da presença do inibidor nas plantas, não houve inibição da atividade de CP de S. levis, provavelmente em função de sua baixa expressão.
Título em inglês
Characterization of the digestive proteinase activity of Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae) and its sensitivity to chagasin
Resumo em inglês
Proteinase inhibitors have been broadly employed in plant transformation aiming insect pest control. Here, we report a detailed study of the digestive proteinase activities present in the midgut of Sphenophorus levis (Coleoptera: Curculionidae) larvae, an important pest of sugarcane. It was observed a major activity of cysteine proteinases and a minor level of serine proteinases. These results led us to introduce into the sugarcane genome a new cysteine proteinase inhibitor called Chagasin. This gene was isolated from Trypanosoma cruzi and its biochemical characterization revealed that the gene product is a strong cysteine proteinase inhibitor. Enzymatic assays were performed using the recombinant form of this protein wich displayed potent inhibitory activity against the cysteine proteinases of S. levis larvae. Gene constructs carring the sequence encoding Chagasin and the reporter gene NPTII were used to transform embriogenic calli of sugarcane via biobalistic. Plants were selected from medium containing Geneticin and were further characterized at the molecular level by PCR, RT-PCR and Western Blotting. Analyses of several transgenic plants confirmed the integration and expression of Chagasin into the sugarcane. Assays using protein extracts of transgenic plants were performed to address a putative inhibitory effect of Chagasin onto the cysteine proteinases of S. levis. The results showed that here was no inhibitory effect of the sugarcane protein leaf extract on the cysteine proteinase activity of the insect larvae. This observation is probably due to the low expression level observed in the transgenic plants.
 
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Data de Publicação
2019-12-19
 
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