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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2019.tde-20191220-112846
Document
Auteur
Nom complet
Chirlei Glienke de Blanco
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 1999
Directeur
Titre en portugais
Guignardia citricarpa Kiely: análise genética cariotípica e interação com o hospedeiro
Mots-clés en portugais
RELAÇÃO PLANTA-FUNGO
ANÁLISE GENÉTICA
CARIÓTIPOS
CITROS
FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
PINTA PRETA
Resumé en portugais
Guignardia citricarpa é um fungo ascomiceto frequentemente isolado como endófito de citros, sendo no entanto o agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC). Na literatura há referências sobre a existência de dois tipos de G. citricarpa, um deles patogênico, e outro não patogênico. Em 1994 obtivemos isolados de G. citricarpa provenientes de folhas de tangerineiras assintomáticas de pomares do Estado de São Paulo, nos quais a doença não era encontrada. A variabilidade morfológica e genética constatada entre eles foi explicada por duas hipóteses, a primeira de que eles pertenciam a uma população não patogênica, mas endofitica deste fungo, e a segunda de que estes isolados eram patógenos latentes. Como em 1996 a doença começou a ser relatada em diversas regiões do país, inclusive em pomares dos quais os isolados endofiticos foram obtidos, o presente trabalho foi realizado com a finalidade de, por meio de estudos genéticos, citológicos e morfológicos, tentar verificar similaridades e diferenças entre os isolados obtidos como endofiticos e isolados patogênicos. Desta forma, 103 isolados de Guignardia spp obtidos de diferentes hospedeiros, regiões e épocas, foram comparados por meio de marcadores de RAPO. Os isolados foram separados em pelo menos 3 grupos distintos geneticamente, sendo agrupados preferencialmente pela forma de isolamento, ou seja, de lesão de MPC ou como endofiticos de folhas aparentemente sadias. Das 343 bandas de RAPO obtidas, uma encontrada exclusivamente em isolados patogênicos, foi clonada e seqüenciada. A partir desta seqüência um par de "primers" foi sintetizado e utilizado com sucesso para discriminar os isolados patogênicos dos demais. Este par de "primers" após testes futuros poderá ser utilizado como diagnóstico molecular de isolados patogênicos de G. citricarpa em pomares de citros. Foi obtido também o cariótipo eletroforético de quatro isolados de G. citricarpa, revelando que este fungo apresenta genoma de no mínimo 21,5 Mb distribuídos em pelo menos 8 cromossomos, não sendo encontrada variabilidade entre os isolados ensaiados. Características morfológicas também foram analisadas. A taxa de crescimento não diferenciou os isolados analisados, mas foi possível separá-los quanto ao tipo de esporulação in vitro, o que concordou com o agrupamento sugerido por meio de marcadores de RAPD. Estudos de germinação in vitro e in vivo, revelaram que os conídios de G. citricarpa possuem germinação apical com formação de apressório, sendo sugerida a adesão como pré-requisito para a germinação in vitro. Neste processo de adesão deve participar uma glucana β 1,6 produzida por um dos isolados estudados. A produção deste e outros exopolissacarídios por dois outros isolados, parece ser dependente do pH e da fonte de carbono utilizada no meio de cultura. Pelos resultados obtidos, sugere-se que os isolados obtidos como endófitos, não são patógenos latentes, podendo inclusive pertencerem a outra espécie de Guignardia. Sendo assim, os isolados patogênicos poderão ser diferenciados dos endofíticos via PCR, utilizando-se o par de "primers" obtido neste trabalho
Titre en anglais
Not avaliable (sem título inglês)
Resumé en anglais
Guignardia citricarpa is an ascomycete fungus frequently isolated from citrus as endophyte, being however the causal agent of the Black Spot of citrus (BSC). There are in the literature references concerning the existence of two types of G. citricarpa, one pathogenic and one non pathogenic. ln 1994 we obtained isolates of G. citricarpa from leaves of asintomatic tangors in orchards of São Paulo state where no disease had been found. The morphologic and genetic variabilities found among them were explained by two hypothesis, the first suggesting that they belong to a non pathogenic or endophytic population, and the second as a latent pathogen. ln 1996 the disease started to be observed in several region of the country, including orchards from which the endophytic isolates were previously obtained. Thus, this present work was developed with the aim of, by means of genetic, cytological and morphologic studies, verify the similarities and differences between G. citricarpa obtained as endophyte and as pathogen. On this basis, 103 isolates of G. citricarpa obtained from different hosts, regions and seasons, were compared by RAPD markers. Isolates were separated in at least 3 distinct groups, being clustered preferentially by isolation protocol, that is, from BSC lesion (pathogen) or from apparently healthy leaves (endophyte). Of 343 RAPD bands observed, one was found exclusively in pathogenic isolates and therefore it was cloned and sequenced. Based on the revealed sequence, a pair of primers was synthesized and used with success to discriminate pathogenic isolates from the others. With additional tests, this pair of primers will be able to help the molecular diagnosis of pathogenic isolates of G. citricarpa in citrus orchards. We have also obtained the electrophoretic karyotype of 4 isolates of G. citricarpa, revealing that this fungus has a genome of at least 21,5 Mb, divided in at least 8 chromosomes. Morphologic characteristics were also analyzed in the two types of isolates. The growth rate did not discriminate the isolates, but it was possible to separate them in terms of sporulation in vitro, resulting in distinct groups already suggested by RAPD markers. Studies of germination in vitro and in vivo showed that G. citricarpa conidium germinates apically, with apressorium formation, and that adhesion seems to be a necessary step for germination in vitro. During adhesion, a β3 1-6 glucan produced by the isolates seems to play a role in the process. The production of this and other exopolysaccharides were anaiyzed by two isolates and seems to be pH and carbon source dependent. Based on the results obtained in this work, we suggest that the isolates referred as endophytes are not latent pathogens. Furthermore, they could even belong to another Guignardia species whereas, pathogenic isolates can be distinguished: from those endophytes by PCR, using a pair of primers developed in this work
 
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Date de Publication
2019-12-20
 
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