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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2019.tde-20191220-115516
Document
Author
Full name
Alda Luiza Loureiro dos Santos
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 1985
Supervisor
Title in Portuguese
Caracterização genética e molecular de estreptococos lácticos
Keywords in Portuguese
BACTÉRIAS LÁTICAS
GENÉTICA MOLECULAR
Abstract in Portuguese
O presente trabalho foi conduzido com duas finalidades principais: (1) obter uma melhor caracterização de linhagens de estreptococos lácticos, pertencentes à Coleção de Fermentos Lácticos do ITAL e (2) estudar o determinismo genético de um sistema de resistência a bacteriófagos presente em S. cremoris linhagem IL 839, pertencente ã coleção de culturas lácticas do INRA, com o objetivo de cloná-lo. Verificou-se que dentre 124 culturas de bactérias lácticas pertencentes à coleção do ITAL, apenas 17 não cresceram a 23°C durante 18 horas, sendo este o primeiro teste de seleção que se efetua com culturas lácticas mesófilas. Essas culturas resistiram bem às temperaturas de cozimento, sem alteração na sua atividade acidificante e apenas duas linhagens, 166 e 280, liberaram espontaneamente bacteriófagos, não devendo ser uti1izadas em fermentos lácticos. Dentre 58 culturas lácticas pertencentes à mesma coleção, 21 apresentaram perfis de plasmídios diferentes, observando-se, para as restantes, 6 tipos de perfis análogos. Todas as culturas que possuíam perfis distintos mostraram-se lisogênicas, com liberação de profagos após indução com luz ultravioleta. Através do espectro lítico apresentado pelas mesmas em relação a fagos virulencos e aos protagos liberados, pode-se classificá-las em três grupos, a saber: grupo G1 = linhagem 168; grupo G2 = linhagens 307, 309, 16 e 262 e grupo G3 = linhagens 310, 96, 97, 305, 163, 175, 179, 162. Observou-se, ainda, que as culturas 310 e 162 apresentavam sistemas de restrição e modificação de 4 log e 2 log, respectivamente em relação aos fagos 66, 67 e 188 no caso da primeira delas e 66 para a segunda. A linhagem de S. cremoris IL 839, apresentou um sistema de restrição e modificação de 5 log em relação ao fago 8. Verificou-se que esta linhagem possui a 8 plasmídios designados de pIL 20 a pIL 27, com pesos moleculares de 3, 5, 6, 9, 14, 15, 17 e 46 Kb. Utilizando-se o método de protoplastização obteve-se cura de plasmídios, podendo-se determinar que nenhum deles estava relacionado ao sistema de R/M. O plasmídio pIL 21, não curado, foi cotransformado juntamente com um plasmídio indicador pHV 1301, resistente à eritromicina, para uma linhagem de S. lactis IL 1403 desprovida de plasmídios, verificando-se que os cotransformantes também não haviam adquirido o sistema de R/M. Concluiu-se, então, que aquele sistema era codificado por genes localizados no cromossomo. Realizou-se digestão parcial do cromossomo com a enzima de restrição Hpa II, posterior seleção dos fragmentos por tamanho em gradiente de sacarose e ligação dos mesmos a um plasmídio vetor pVA 749Δ possuindo marca de resistência à eritromicina, também linearizado pela mesma enzima. Células de S. lactis IL 1403 transformadas por este DNA recombinante possuíam somente o plasmídio vetor, o qual não consegue se manter dentro daquela linhagem desde que possua uma inserção.
Title in English
Not available
Abstract in English
This work was done with two main purposes: (1) to obtain a better characterization of lactic streptococci belonging to the Food Technology Institute (ITAL - Brazil) Collection of Lactic Starters, and (2) to study the genetic determination of a phage resistance system found in S. cremoris strain IL 839, belonging to a Collection of Lactic Cultures of the National Institute of Agronomic Research (INRA - France), with the objective of cloning it. It was found that among 124 lactic bacterial cultures belonging to ITAL collection, only 17 failed to grow during 18 hours at 23°C, being this the first selection performed with mesophylic lactic cultures. These cultures resisted well to cooking temperature without alteration of their acidifing activities and only two strains, 166 and 280, spontaneously released their bacteriophages and were therefore not recommended as lactic starters. Among the lactic cultures from this collection, 2 out of 53 showed profiles of plasmids while in the remaining 37, 6 types of analogue profiles were observed. All cultures that showed different profiles were found to be lysogenic, releasing prophages after exposure to ultraviolet light. The lyctic sprectrum showed that based on virulent phages and on prophages released, one can classify the cultures in three groups: G1 = strain 168; G2 = strains 307, 309, 16 and 262 and G3 = strains 310, 96, 97, 105, 163, 175, 179 and 162. It was also observed that the cultures 310 and 162 showed restriction and modification systems of 4 log and 2 log, in relation to phages 60, 67 and 188 in the first case, and 66 for the second, respectively. The S. cremoris IL 839 showed a restriction and modification system of 5 log in relation to phage 8. It was found that this strain had 8 plasmids termed pIL 20 to pIL 27, with seizes of 3, 5, 6, 9, 14, 15, 17 and 46 Kb. The protoplastization method enabled the curing of plasmids and showed that none were related to the R/M system. The plasmid pIL 21, not cured was cotransformed with the plasmid pHV 1301, used as a marker for erythromycine resistance, in S. lactis IL 1403, not provided with plasmicis. It was found that the cotransformed culture also failed to acquired the R/M system. It was concluded that the system was codified by genes present on the chromosome. A partial digestion of the chromosome was performed with the restriction enzyme Hpa II, selection of fragments by size in a sucrose gradient followed by ligation to the vector plasmid pVA 749Δ which harbours a resistant mark for erythromycine, and was linearized by the same enzyme. Cells of S. lactis IL 1403 transformed by this recombinant DNA had only the vector plasmid probably because the fragment insertion prevents it of surviving in this line.
 
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Publishing Date
2019-12-20
 
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