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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2019.tde-20191220-141222
Documento
Autor
Nome completo
Alejandro Chaparro Giraldo
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 1999
Orientador
Título em português
Efeitos pleiotrópicos em plantas transgênicas de batata (Solanum tuberosum L.) Cv. Bintje associados à expressão da leghemoglobina de soja no interior dos cloroplastos
Palavras-chave em português
BATATA TRANSGÊNICA
CLOROPLASTOS VEGETAIS
DISPONIBILIDADE
LEGHEMOGLOBULINA DE SOJA
OXIGÊNIO
Resumo em português
O oxigênio atua como substrato ou cofator em muitas reações bioquímicas tanto no metabolismo primário quanto no secundário no reino vegetal. A principal forma de acelerar os processos bioquímicas dependentes de oxigênio nas plantas é elevar a concentração externa desse gás. Porém, em termos econômicos, é praticamente inviável de ser realizado em grande escala. Uma alternativa para contornar esse problema é aumentar a disponibilidade de uma proteína cuja característica baseia-se na alta afinidade por oxigênio. As hemoglobinas vegetais (Hbs) estão amplamente distribuídas nas plantas e geralmente, apresentam uma alta afinidade pelo oxigênio. Elas podem ser divididas em dois grupos: simbiontes e não simbiontes. Dentro do tipo simbionte encontra-se a leghemoglobina de soja (Lb), que apresenta unia das maiores afinidades pelo oxigênio. Um local interessante para alterar a disponibilidade do O2 é o interior do cloroplasto, devido a sua participação nos processos metabólicos básicos. Com o objetivo de alterar a disponibilidade de oxigênio no interior dos cloroplastos, foi introduzido no genoma da batata (Solanum tuberosum L.) via Agrobacterium tumefaciens, uma construção quimérica constituída pelo gene(lb) que codifica a leghemoglobina de soja, ligado à seqüência de direcionamento aos cloroplastos da subunidade pequena da Rubisco de ervilha (Pisum sativum L.), sob o controle do promotor 35S do CaMV. A partir de discos de minitubérculos cocultivados com Agrobacterium obtiveram-se plântulas regeneradas m meios seletivos, que foram analisadas por PCR, RT-PCR e Westem Blotting, demonstrando-se o carácter transgênico dos regenerantes. Análises de imunodetecção em frações enriquecidas de cloroplastos revelaram que a Lb foi eficientemente importada e corretamente processada no interior dos cloroplastos da batata transgênica. Não foram detectadas modificações nas atividades das enzimas CAT, SOD e GR nas plantas transformadas em condições da casa de vegetação e em condições de estresse salino in vitro. Porém, foram verificadas alterações negativas no desenvolvimento e produção de tubérculos, assim como alterações na síntese de amido, em condições de casa de vegetação. Aumento no número de nós e indução de microtuberização espontânea foram características detectadas nas plantas transgênicas cultivadas in vitro. Plântulas transgênicas submetidas à uma concentração de 100 mM de NaCI em condições in vitro demonstraram uma maior susceptibilidade ao estresse salino do que plantas controle. Os resultados sugerem que a Lb de soja no interior dos cloroplastos promove efeitos pleiotrópicos nas plantas transgênicas de batata, provavelmente criando condições estressantes ao seu desenvolvimento e metabolismo.
Título em inglês
Pleiotropic effects in transgenic potato plants associated with the expression of the soybean leghemoglobin inside the chloroplasts
Resumo em inglês
Oxygen acts as a cofactor or substrate in many biochemical processes in both primary and secondary plant metabolism. One possible way to increase oxygen availability inside the cell in order to stimulate oxygen-dependent reactions, is through oxygen binding proteins which increase the intracellular oxygen concentration. Plant hemoglobins (Hbs) are largely widespread in the plant kingdom, and generally display a high affinity to oxygen. Hbs may be classified into two broad groups: symbiotic and nonsymbiotic types. Symbiotic Hbs have been extensively characterized in legume plants and are involved with the facilitation of oxygen diffusion within infected tissues. One of the best studied and characterized class of symbiotic Hbs is the soybean leghemoglobin (Lb), which represent a small family of closely related genes. Soybean Lb accumulates in high leveIs in infected tissue and has a high avidity for oxygen and a relatively fast oxygen-dissociation rate which permits low cellular concentration of free oxygen. In order to verify whether the presence of the symbiotic soybean Lb inside the potato chloroplasts would interfere on aerobic metabolism in the transgenic plants, a chimeric gene made by the fusion of the soybean leghemoglobin with the chloroplastic targeting sequence from the small subunit precursor of Rubisco (rbcS) from pea, was introduced into potato genome via Agrobacterium tumefaciens ti-derived vector. Transgenic plants were analysed by PCR, and Lb expression was further monitored by RT -PCR. Westem Blotting in a chloroplastic-enriched fraction from transgenic potato plants showed that Lb was imported and correctly processed inside the organelle. Analysis of CAT, SOD and GR enzyme activities involved in the protection against oxidative stress damage were not affected by the presence of soybean Lb. Besides, carbohydrate levels from transgenic and control plants were not altered. On the other hand, plant growth, development and tuberization, were significantly reduced as well as plant growth in saline conditions, suggesting that Lb expression inside the chloroplasts promotes pleiotropic effects on transgenic potato plants.
 
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Data de Publicação
2019-12-20
 
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