Muitos dos açúcares precursores de hemiceluloses, como UDP-arabinose, UDP-xilose, ácido UDP-galacturônico, UDP-apiose e derivados metilados são provenientes de um precursor comum, o UDP-glucuronato. A síntese de UDP-glucuronato é mediada pela enzima UDP-glicose desidrogenase a partir de UDP-glicose, entretanto, existe uma rota biossintética secundária, a rota de oxidação do inositol, cujos passos regulatórios são pouco conhecidos. A alteração do metabolismo do mio-inositol nas plantas tem despertado grande interesse em razão de sua participação em vários processos metabólicos. Uma vez produzido, o mio-inositol pode seguir várias rotas metabólicas (Loewus & Loewus, 1983) ou ser oxigenado pela enzima mio-inositol oxigenase, formando ácido glucurônico. Essa reação é irreversível e o produto formado pode ser diretamente transferido para a síntese da parede celular ou ser fosforilado pela enzima glucuronoquinase. Este trabalho teve como objetivo clonar o cDNA do gene miox que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (EC 1.13.99.1) para modulação da sua expressão, via anti-sense, em plantas de tabaco. A estratégia de clonagem iniciou-se com a busca de genes no banco de dados do NCBI. A seqüência ortóloga da espécie vegetal encontrada, com alto grau de homologia com o gene de Sus scrofa (primeira espécie a ter o gene seqüenciado e caracterizado) foi a de Arabidopsis thaliana. Assim, a seqüência de nucleotídeos dessa, foi utilizada para a confecção dos primers para a ORF do gene da mio-Inositol oxigenase, contendo a sequência de direcionamento CACC no primers 3’ (para clonagem direcional anti-sense do gene). Realizou-se o isolamento do gene miox de A. thaliana através da extração de mRNA desta espécie, que foi em seguida, submetido a reação de RT-PCR com primers específicos para a ORF do gene. Esse produto da reação RT-PCR foi usado como sonda na análise de Southern blot e para clonagem do gene. Para a clonagem, foi necessário primeiro clonar o produto da reação RT-PCR no vetor TOPO seguida de transformação química de células competentes de Escherichia coli (TOP 1 O). Em seguida, procedeu-se a reação LR clonasse para clonagem no vetor binário de transformação de plantas (Gateway - Invitrogen), seguido de transformação química de células competentes de E. coli (DH5oc). A transfomação da linhagem EHA105 de Agrobacterium tumefaciens, com o plasmídio Gateway recombinante (pK7WG2D/anti-sense-miox) foi feita por eletroporação e os clones recombinantes foram selecionados. A transformação de plantas de tabaco foi realizada por infecção de discos foliares com o clone de A. tumefaciens (EHA105) que contém o transgene. A confirmação da presença do transgene nos brotos transformantes foi feita por análise de PCR, com primers do gene nptll, de resistência à canamicina. Essas plantas transgénicas foram cultivadas, sob condições de ambiente controlado, para produção de sementes e posterior avaliação da progênie, quanto à segregação do gene de resistência à canamicina. A expressão do transgene na progênie T₂, foi avaliada por Northern blot e através de quantificação dos componentes da parede celular, como carboidratos, lignina e ácidos urônicos. A expressão do gene miox anti-sense das plantas transgénicas causou acúmulo de arabinose e de ácido glucurônico no caule destas plantas.

The sugar precursors for hemicellulose biosynthesis, such as UDP-arabinose, UDP-xylose, UDP-galacturonic acid, UDP-apiose and methyl derivates are formed from a commom precursor, UDP-glucuronate. UDP-glucuronate is mainly formed by the action of UDP-glucose dehydrogenase. However, a second biosynthetic route is present in higher plants which involves the oxidation of myo-inositol. This second metabolic route is still not well understood. Changing the myo-inositol pathway in plants is of great interest mainly to change the regulation of hemicelluloses biosynthesis. Once produced, myo-inositol can enter several pathways (Loewus & Loewus, 1983) or can be oxidized by myo-inositol oxygenase, forming glucuronic acid. This reaction is irreversible and the product is directly transferred to cell wall synthesis or phosphorylated by glucuronokinase. The aim of this work was to clone the mio cDNA, which codes for myo-inositol oxygenase (EC 1.13.99.1) and modulate its expression, by anti-sense in tobacco plants. The cloning strategy started by searching for genes in the NCBI gene bank. The plant orthologue sequence, with highest degree of homology with the Sus scrofa gene (first miox gene to be sequenced and cloned), was from Arabidopsis thaliana. This nucleotide sequence was used as a template to design primers for myo-inositol oxygenase ORF gene, adding the direction sequence CACC to the reverse primer, to orientate anti-sense cloning. Gene cloning was performed by A. thaliana mRNA extraction, followed by RT-PCR with miox ORF specific primers. The RT-PCR product was used as a probe for Southern blot and for cloning. The RT-PCR product was first cloned in a TOPO vector followed by transformation of Escherichia coli competent cells (TOP 1 O). The LR clonase reaction was performed for cloning into a plant binary vector (Gateway - Invitrogen), followed by E. coli (DH5α) transformation. Agrobacterium tumefaciens strain EHA 105 was transformed by eletroporation with the recombinant Gateway (pK7WG2D/ anti-sense miox). Tobacco plants were transformed by Agrobacterium leaf discs infection. Transgenic plants were selected using kanamycin resistance and verified by PCR, using nptII primers. These plants were grown, under controlled environmental conditions, for seed production and half sib analyses for kanamycin resistance gene segregation. Transgenic gene expression in the T₂ generation was analyzed by Northern blot and analysis of cell wall compounds, such as carbohydrates, lignin and uronic acids. Anti-sense miox gene expression caused arabinose and glucuronic acid retention in transgenic plant stems.