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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.2020.tde-20200111-131454
Documento
Autor
Nome completo
José Raulindo Gardingo
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 1998
Orientador
Título em português
Resposta embriogênica e estabilidade cromossômica em calos derivados de linhagens e híbridos de milho (Zea mays L.)
Palavras-chave em português
CULTURA DE CALOS VEGETAIS
EMBRIOGÊNESE
ESTABILIDADE CROMOSSÔMICA
LINHAGENS VEGETAIS
MILHO HÍBRIDO
Resumo em português
A resposta embriogênica em culturas de calos de milho, depende principalmente do genótipo, explante, meio de cultura, duração do cultivo in vitro e estabilidade cromossômica. O presente trabalho faz parte de um programa cujos objetivos são o de se selecionarem genótipos altamente responsívos ao cultivo in vitro, apresentando baixo grau de instabilidade cromossômica em culturas de calos. Em experimentos anteriores, foi detectada maior freqüência de embriogênese somática em calos induzidos a partir de uma família de linhagens designada 1-3, derivada de uma variedade tipo flint (Fluminhan, 1992). A análise citogenética destas culturas mostrou a presença de pontes anafásicas, evidências de ocorrência de ciclos de quebra-fusão-ponte e maior incidência de aberrações em cromossomos com knobs heterocromáticos de tamanho médio e grande (Fluminhan, 1992; Aguiar-Perecin e Fluminhan, 1992; Fluminhan, Aguiar-Perecin e Santos, 1996). A análise de duas culturas derivadas de linhagens da família 1-3 mostrou que as mesmas tem alta capacidade para o cultivo in vitro por longos períodos (Santos, 1995; Santos e Aguiar-Perecin, 1995). Além disso, em uma das culturas observou-se menor freqüência de aberrações mitóticas e de alterações cromossômicas, bem como maior capacidade de regenerar plantas férteis. No presente trabalho foram induzidas culturas a partir de embriões imaturos derivados de linhagens relacionadas àquelas utilizadas por Santos e Aguiar-Perecin (1995) e respectivos híbridos, com os seguintes objetivos: a) Avaliar a resposta embriogênica de genótipos relacionados em culturas de curta duração (45 - 60 dias) e de longa duração (1 ano); b) Avaliar a ocorrência de aberrações cromossômicas em culturas derivadas de linhagens e híbridos com diferenças em sua composição de knobs e estado homozigótico ou heterozigótico dos mesmos. As linhagens empregadas designadas 132331/1, 13342/1 e 13342/5 apresentam knobs nas posições 6L2, 6L3, 7S, 7L e 8L1. A linhagem 132331/1 apresenta também um knob em 9S, enquanto que a linhagem 13342/1 um knob em 3L. Para tais avaliações inoculou-se de 25 a 30 embriões imaturos (1-2 mm) por placa de Petri, cerca de 80 embriões por planta. As culturas foram mantidas a 28°C no escuro, em meio N6 contendo 1,5 mg/l de 2,4-D e 12 mM L-prolina, realizando-se os subcultivos a cada 14-20 dias. Observou-se que a capacidade para a cultura de tecidos é excelente, pois a freqüência de indução de calos embriogênicos está acima de 97%, a capacidade de formação de calos embriogênicos aos 45 dias variou de 81,76% (132331/1) a 89,42% (13342/1 x 13342/5). Aos 6 meses de cultura foi realizada uma seleção dos calos embriogênicos com maior taxa de crescimento e observou-se que a capacidade de manutenção de culturas aos 12 meses variou de 1,28% (132331/1) a 5,00% (13342/5) em relação aos embriões inoculados. Para a análise citogenética das culturas, foram utilizados respectivamente 5 e 10-15 calos por planta, aos 2 e 3-4 meses após a inoculação. Também foram analisados alguns calos no período entre 4 e 7 meses de idade da cultura. A análise de metáfases e prometáfases coradas pela metodologia de bandamento-C mostrou que nas culturas com 2 meses de idade a freqüência de células normais variou de 73,7% a 97,2%. Para os calos aos 3-4 meses, observou-se que a freqüência de células normais variou de 88,9% a 96,8%, sendo as linhagens aparentemente inferiores aos híbridos. Aos 4-7 meses, a proporção de células normais foi superior a 78%. De uma maneira geral, observou-se que houve predomínio de alterações estruturais, sendo que o cromossomo 7 estava envolvido em mais de 60% das alterações, alterações estas ligadas às regiões dos knobs nos dois braços. Foram constatadas várias evidências de ciclos de ponte-quebra-fusão nestas culturas. Entre os tipos de alterações do cromossomo 7 observaram-se alterações nas bandas-C (correspondentes aos knobs heterocromáticos) amplificadas, duplicadas, reduzidas, terminais (braço longo) e subterminais (braço curto), bem como anéis e translocações recíprocas. O cromossomo 9 que apresenta um grande bloco de heterocromatina terminal apresentou poucas alterações aos 3-4 e 4-7 meses, geralmente em células em que havia um cromossomo 7 alterado. Entre os tipos menos freqüêntes tem-se as células tetraplóides, trissômicas, etc. Vários tipos de alterações observados em cromossomos portadores de knobs podem ser interpretados como originados a partir de atraso na separação das cromátides ao nível dos knobs seguidos de ciclos de quebra-fusão-ponte. No caso do cromossomo 7, há também a possibilidade de em alguns casos, o evento primário ser uma amplificação do knob, seguido de ocorrência de quebra cromossômica e ciclos de quebra-fusão-ponte. Assim, pode-se concluir que o experimento realizado permitiu a escolha de genótipos que são capazes de produzir calos friáveis altamente embriogênicos com baixo grau de instabilidade cromossômica.
Título em inglês
Embryogenic response and chromosomal stability in calli derived from maize (Zea mays L.) lines and hybrids
Resumo em inglês
The embryogenic response of maize callus cultures depend on the genotype, explant, culture medium, culture age and chromosome stability. This work is part of a program which objectives are to screen genotypes highly responsive to in vitro culture, and showing low degree of chromosome instability in calli cultures. ln previous experiments, a high frequency of somatic embryogenesis was observed in calli derived from a family of lines designated 1-3, originated from a flint variety (Fluminhan, 1992). The cytogenetic analysis of these cultures showed the presence of anaphase bridges, evidences of the occurrence of break-fusion-bridge cycles and a higher incidence of abnormalities in chromosomes bearing medium and large-sized heterochromatic knobs (Fluminhan, 1992; Aguiar-Perecin & Fluminhan, 1992, Fluminhan, Aguiar-Perecin, Santos, 1996). The analysis of two cultures derived from lines of the family 1-3 showed that both have high ability for long-term in vitro cultivation (Santos, 1995; Santos & Aguiar-Perecin, 1995). Futhermore, one of the cultures showed low frequency of mitotic abnormalities and chromosome alterations, as well as a greater ability of regenerating fertile plants. ln the present work cultures from immature embryos were induced from tines related to those utilized by Santos & Aguiar-Perecin (1995) and the corresponding hybrids aiming to: a) Evaluate the embryogenic response of related genotypes in short (45-60 days) and long-term (1 year) culture; b) Evaluate the occurrence of chromosome abnormalities in cultures derived from tines and hybrids bearing slight differences in their knob composition and their heterozygous or homozygous state. The tines used, designated 132331/1, 13342/1 and 13342/5 have knobs at 6L2, 6L3, 7S, 7L e 8L1. The line 132331/1 also shows a knob at 9S, while line 13342/1 has a knob at 3L. For the evaluation of the embryogenic response, 25-30 immature embryos (1-2 mm) were inoculated per Petri dish, approximately 80 embryos per plant. Cultures were maintained in N6 medium supplemented with 1,5 mg/l 2,4-D and 12 mM L-proline, by subculturing every 14-20 days, at 28°C in the dark. The frequency of embryogenic calli induction was higher than 97%. The ability of cally formation at 45 days ranged from 81,76% (132331/1) to 89,42% (13342/1 x 13342/5). At 6 months after culture initiation, fast growing embryogenic calli were selected. Twelve-month-old cultures were scored and ranged from 1,28% (132331/1) to 5,00% (13342/5) of the embryos inoculated. For cytogenetic analysis, 5 and 10-15 calli per plant were sampled, respectively at 2 and 3-4 month after culture initiation. The analysis of C-banded metaphases and prometaphases showed that in 2-month-old cultures the frequency of normal cells ranged from 73,7% to 97,2%. In 3-4-month-old calli, the frequency of normal cells ranged from 88,9% to 96,8°/o, and was higher in the hybrids. Structural abnormalities were the most frequent alterations observed, and chromosome 7 was involved in more than 68% of theses alterations, most of them, related to knob regions of both arms. Many evidences of break-fusion-bridge cycles were observed in theses cultures. Among the aberrations of chromosome 7, C-band alterations (corresponding to knobs) such as band amplification, duplication, reduction, terminal (long arm) and subterminal (short arm) bands as well as rings and reciprocal translocations were observed. Chromosome 9 which has a great block of terminal heterochromatin at the short arm, showed few alterations at 3-4 and 4-7 months after culture initiation, generally in cells carrying an altered 7 chromosome. Among the less frequent alteration types were tetraploid, trissomic cells, etc. Observed in knobbed chromosomes may have been originated from delayed separation of sister chromatids at knob sites followed by breakage-fusion-bridge cycles. Also, knob amplification may have been the primary event that gave origin to alteration of chromosome 7. So, the present work provided selection of genotypes with high capability to produce highly embryogenic calli (type-2) with low level of chromosome instability.
 
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Data de Publicação
2020-01-11
 
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