As enzimas são amplamente empregadas na indústria (fármacos, alimentos, tintas, biodegradação, etc), devido a sua capacidade de catalisar reaçoes biológicas. Atualmente, a evolução dirigida permite a obtenção de enzimas mais eficientes e/ou estáveis. Este método consiste em gerar variabilidade por meio do PCR, introduzindo mutaçoes aleatórias na molécula de DNA que codifica a proteína de interesse. Em seguida, faz-se a clonagem do DNA mutante e, posteriormente, a avaliação e seleção dos clones desejáveis expressando a proteína de interesse. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo integrar à este sistema de melhoramento de proteínas, a utilização da Green Fluorescent Protein (GFP) como um gene repórter, a fim de que este, por meio de sua fluorescência, auxiliasse o processo de seleção das moléculas mais ativas. Neste estudo, foi utilizada como modelo a ẞ-glucosidase A (BgIA) de Fervidobacterium sp. (Sullí­van et al., 1998), de interesse na biodegradação da celulose devido a sua termoestabilidade. O gene desta enzima, bem como o da GFP (pGFPmut3.1, Clontech), foram clonados num vetor de expressão (pBADMycHis, Invitrogen) induzí­vel por arabinose. Para tanto, uma série de plasmídios, bem como uma nova variável da GFP (GFP309), foram criados resultando nos vetores pBBGH e pBBSGH. Estes vetores binários conferiram às células de Escherichia coli a capacidade de produção de uma proteína quimérica ativa, composta pela BgIA fusionada à GFP, seguida de uma cauda de 6 histidinas. A produção desta fusão foi otimizada, seguida de sua purificação (Imobilized Metal Affinity Chromathography - IMAC) caracterização (temperatura ótima, especificidade pelo substrato, termoestabilidade, etc). Foram estabelecidas as condiçoes para a obtenção de moléculas mutantes da BgIA por meio da técnica de Error Prone PCR (EPP), sendo construída uma biblioteca de clones mutantes, que foram avaliados por meio do índice obtido entre a atividade da BgIA e a fluorescência da GFP (BgIA/GFP). Os clones com superior índice (BgIA/GFP) foram selecionados e suas respectivas fusões purificadas e caracterizadas. Não foi verificada correlação entre este í­ndice e a atividade especifica da BgIA nas fusões mutantes purificadas. Aqui são sugeridas as fontes de variação que reduziram a correlação entre estes parâmetros e, entre elas, são consideradas: a interação entre as moléculas que compõem a fusão, a instabilidade plasmodial, a suscetibilidade da fusão á proteólise e a não automatização total dos ensaios.

Enzymes are proteins able to catalyze biological reactions and for this reason they are largely used in biotechnological processes (drugs, food, paint, fuel, bioconversion, etc). Today, one of the most promising strategy of engineering proteins to obtain more active and/or stable molecules is the directed evolution. This approach is based on the generation of variability through the obtaintion of mutant DNA molecules that codify the protein of interest, followed by its screening. The present work was aimed to integrate to this evolutionary method, the use of the green f1uorescent protein (GFP) as a reporter. In this case the GFP will work as a tool aiding the process of selection of the most active molecules. In this study, ẞ-glucosidase A (BgIA) of Fervidobacterium sp. (Sullivan et a/., 1998) was used as a model, an enzyme that is of biotechnological interest in cellulose degradation due to its thermostability. The gene of this enzyme, as well the one that codifies the GFP protein (pGFPmut3.1- Clontech), were cloned into a vector (pBADMycHis- Invitrogen). After the construction of a sene of plasmids and the obtaintion of a new derived GFP molecule (GFP309), a final pair of expression vectors (pBBGH and pBBSGH) were obtained. The expression of those vectors allowed Escherichia colí cells to produce a chimeric active protein, composed by the BglA fused to GFP, and these, linked to a histidine tag. The fusion production was optimized, followed by its purification (lon Metal Affinity Chromathography - IMAC) and characterization (optimal temperature, substrate specificity, thermostability). Based on the existence of a proportion of 1: 1 between the number of molecules of each protein in the fusion, the selection of enhanced BglA mutants was studied through the index obtained by the ratio between the BglA activity and the GFP fluorescence (BgIAlGFP). In order to do that, the conditions to produce mutant molecules of BglA were established by the Error Prone peR technique. A library of mutant molecules was built and evaluated in Escherichia colí Some clones were selected through the index (BgIAlGFP), and then its fusion was purified and characterized. No correlation was verified between the index obtained and the specific activity of BglA from pure fusion samples. Based on the assays performed, some of the sources that could be generating the difference observed between the index and the specific activity of the fusion are suggested: the different interaction among the molecules that compose the fusion, the plasmidial instability, susceptibility of the fusion to proteolysis, and non totally automated assays.