O motivo de dupla arginina na região amino-terminal é uma característica das proteínas direcionadas pela via Tat. O direcionamento das proteases cloroplastidiais do tipo FtsH (cpFtsH) que contém motivo característico mostrou ser dependente de componentes da maquinaria de translocação T at. Contudo, análises genômicas mostraram que as proteínas FtsHs de plantas e cianobactérias podem ser separadas em três clados distintos. O primeiro grupo contém o motivo RR na região N-terminal, próximo ao primeiro segmento transmembrana. Os outros dois grupos não apresentam um motivo de dupla arginima apesar de terem duas argininas consecutivas encontradas na região lumenal que liga os dois domínios transmembranas. A FtsH5, uma protease que pertence ao terceiro grupo e uma série de construções envolvendo deleções na região e-terminal deste gene foram fusionados à GFP e usadas para avaliar os determinantes estruturais responsáveis pelo direcionamento da proteína para os tilacóides. Nossos resultados mostram que a proteína FtsH5 completa fusionada à GFP é corretamente direcionada para a membrana dos tilacóides, porém a região N-terminal não é suficiente para transportar a proteína GFP corretamente. Estes resultados são contrastantes com os dados obtidos para a proteína FtsH2, que apresenta o motivo clássico de dupla arginina, no qual o direcionamento pode ser mediado apenas pela região N-terminal. Nossos dados indicam que os determinantes para o direcionamento das FtsHs variam nos diferentes grupos. O requerimento da região e-terminal para o direcionamento da FtsH5 sugere a existência de um mecanismo de transporte alternativo.

A twin-arginine-containing N-terminal sequence motif is characteristic for proteins that are targeted by the Tat-pathway. Targeting of a chloroplast FtsH protease (cp-FtsH) that contains such a motif has been shown to depend on components of the twin-arginine translocation (Tat)-pathway. However, phylogenetic and sequence comparison analyses showed that FtsH proteins of plants and cyanobacteria could be separated into three distinct clades. The first group contains a stroma-facing RR-motif near the N-terminus upstream of the first hydrophobic domain. The other two groups lack an obvious twin- arginine motif, albeit two consecutive arginines are found in a conserved lumenal region that links the trans-membrane domains. FtsH5, a group 3-belonging protease, and a series of e-terminal deletions of FtsH5 were fused to GFP and used to reveal structural determinants for the targeting to thylakoids. Our results show that only the full-length fusion protein was correctly targeted to thylakoid membranas, whereas the N-terminal region was not sufficient to correctly deliver GFP to thylakoids. In contrast, for FtsH2, which carries the classical twin-arginine motif, we found that targeting can be mediated by the N-terminal region alone. Our data indicate that the targeting determinants for FtsH vary in the different classes. The requirement of the e-terminal domain for the targeting of FtsH5 suggests the existence of an unusual targeting pathway.