Foi feito um estudo dos genes envolvidos como processo de fixação assimbiótica de N₂, em populações bacterianas selvagens do solo, com o intuito de se verificar a ocorrência de genes nif plasmidiais, ou mesmo cromossomais, que pudessem ser transferidos para outros sistemas não fixadores. Foi observada a presença de plasmídeos nos isolados naturais 2-2II, 5-3 e 40-1 com pesos moleculares de 64,40 e 92 Md, respectivamente, revelados por eletroforese em gel de agarose. Em nenhuma destas linhagens se detectou a presença de genes plasmidiais envolvidos com o processo de fixação de N₂, uma vez que após a eliminação dos plasmÍdios com agentes de “cura”, estas continuaram seu desenvolvimento normal em meio isento de nitrogênio incorporado. A maior porcentagem de eliminação de plasmídios foi conseguida atrvés do tratamento com temperatura de 44ºC (2 a 10%), seguida do tratamento com brometo de etídio (1 a 5%), sendo menores as obtidas com acriflavina (0,5 a 1%) e acridina laranja (0,2 a 0,8%). Pode-se verificar que a presença, assim como o tamanho dos plasmÍdios presentes, não foi uma constante, pois variaram com a espécie, mostrando a grande variabilidade genética deste material. O isolado selvagem 9, não portador de plasmídio, classificado como Azotobacter paspali, foi estudado sob vários aspectos genéticos. Teve-se como objetivo, a localização dos genes nif nesta bactéria, procurando-se ainda uma similaridade com outras espécies do mesmo gênero, bem estudadas geneticamente. Neste sentido, inicialmente foram isolados alguns mutantes auxotróficos e nif ^- (incapazes de fixar N₂), a partir da indução com luz ultravioleta tratamento com ácido nitroso. A localização de algumas mutações nif foi possível através da transformação destes mutantes nif ^- com DNA de A. paspali selvagem e mutante, verificando-se que os genes estavam ligados na maioria dos casos. Também foram obtidos transformantes nif ⁺ de Escherichia coli, utilizando-se DNA de A. paspali, os quais apresentaram reduzida atividade de nitrogenase, avaliada pela redução do acetileno. Estes transformantes nif ⁺ foram ensaiados posteriormente, em vários processos de conjugação, com linhagens de E. coli. A partir desses experimentos, pode-se verificar que o sistema estudado apresenta algumas similaridades com outras espécies de Azotobacter, no que diz respeito à localização dos genes nif no genoma bacteriano. No entanto, a ocorrência de transformantes nif ⁺ de E. coli, sugere que a maioria dos genes nif funcionais estão em um grupo passível de ser transferido por um único segmento de DNA.

In soil bacteria plasmidial and chromosomal genes related to N₂ fixation were screened and selected. For genetic studies and also to evaluate their transfer potential to other biological systems. The presence of plasmids were detected in the natural isolates 2-2II, 5-3 and 40-1 with molecular weight 64, 40 and 92 Md respectively, determined by agarose gel electrophoresis. None of these strains had plasmidial fixation genes since after plasmidial elimination (“cure”) growth remained normal in media without nitrogen. Best plasmid “cure” was obtained after 44ºC temperature treatment (2 – 10%) folowed by ethidium bromide (1 – 5%) and the lowest elimination was obtained by acriflavin (0, 5 – 1%) and acridine orange (0,2 - 0,8%). Variability was observed for the presence and plasmid size. One of the isolates (number 9), classified as Azotobacter paspali and a nitrogen fixer strain with no plasmid detected was studied geneticaly with the objective of nif genes location. Auxotrofic and non fixing mutants (nif ^-) were isolated after treatment by UV light and nitrous acid. Complementation analysis after genetic transforrnation of nif ^- mutants in all possible combinations permited to detect linkage for the markers under analysis. By genetic transformation it was possible to transfer the fixation ability of A. paspali to Escherichia coli, although with reduced nitrogenase activity as evaluatedby acetilene reduction. E. coli transformants were evaluated after conjugation experiments with different E. coli strains. Regarding to nif genes location on the bacterial genome the studies revealed similarities with other Azotobacter species. However taking in account the transformation of E. coli for nif ⁺ suggests the possibility that most functional nif genes are clustered able to be transfered by a single DNA segment.