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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.1989.tde-20210104-182908
Document
Author
Full name
Maria José Valarini
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 1988
Supervisor
Title in Portuguese
Métodos de biologia molecular e esferoplastização aplicados a Rhizobiaceae
Keywords in Portuguese
BACTÉRIAS FIXADORAS DE NITROGÊNIO
ESFEROPLASTOS
GENÉTICA MOLECULAR
TRANSFERÊNCIA GENÉTICA
Abstract in Portuguese
O presente trabalho objetivou o estudo de alternativas de transferência genética em Rhizobium e Bradyrhizobium. Para tal, células de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli C05 e de Bradyrhizobium spp, isolado natural da leguminosa forrageira tropical Neonotonia wightii, foram ensaiadas para alguns métodos de biologia molecular, incluindo introdução de elemento de inserção genética e utilização de vetor de clonagem, isolamento de mutantes, detecção de plasmídios em gel de agarose, isolamento de DNA total e construção de banco genômico em E. coli e esferoplastização. Mutantes metionina-deficientes induzidos por U.V. e por introdução do transposon Tn5, foram isolados com freqüências de 0,7x.10-3 (0,15%) e 0,6.10-3 (0,18%), respectivamente, e utilizados como marcadores genéticos, em conjugação triparental. Introdução do transposon Tn5, através do vetor suicida pJB4JI portador do fago Um, em R. leguminosarum biovar phaseoli C05 se deu a uma freqüência da ordem de 10-3. O perfil de DNA plasmidial, em gel de agarose, obtido para ambas as espécies mostrou a presença de banda plasmidial para a espécie de Rhizobium mas não para a espécie de Bradyrhizobium, reiterando a dificuldade de detecção deste elemento ou que neste gênero os genes “nif” e “nod” não estejam localizados em grandes plasmídios. Através de pré-tratamento com glicina e, em seguida, com lisozima foi possível obtenção de esferoplastos e/ou protoplastos em 90% das células com menos de 6 horas de tratamento. Células de Rhizobium e Bradyrhizobium apresentam resistência à reação de lisozima. Utilizando-se do vetor de inativação insercional pUC 119 foi construído um banco genômico de DNA total da estirpe de Bradyrhizobium spp, e estabelecido, por transformação, em E. coli HB101. O plasmídio híbrido resultante conteve fragmentos de DNA de 10-20 kilobases inseridos no sítio de poliligação da região lac z do pUC 119. Mobilização de plasmídio pSUP 5011::Tn5 mob+ para R. leguminosarum biovar phaseoli C05 foi observada a uma freqüência de 0,4.10-5, através de sistema plasmidial binário, incluindo o vetor de transcomplementação pRK2013 (tra+).
Title in English
Methods on molecular biology and spheroplasting applied to Rhizobiaceae
Keywords in English

Abstract in English
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli C05 and a wild strain of Bradyrhizobium, isolated from the tropical forage legume Neonotonia wightii, were tested for the procedures of molecular biology, including introduction of the transposon Tn5, mutagenesis U.V. and transposon-induced, plasmid DNA detection, total DNA isolation, and genetic cloning and transfer in E. coli (genomic bank) and spheroplasting. Methionine-requiring mutants U.V. and transposon Tn5-induced were isolated in the frequencies of 0,7.10-3 (0,15%) e 0,6 x10-3 (0,18%) respectivelly. These mutants were used, associated with antibiotic resistances, as genetic markers in triparental matings. The transposon Tn5 was introduced into the genome of R. leguminosarum biovar phaseoli C05, through the suicide vector pJB4JI carrying Mu phage, in the frequency of about 10-3. The plasmid DNA profile in the agarose gel only showed the presence of plasmid band to the Rhizobium species. Similar plasmid DNA cannot be detected in Bradyrhizobium species, reiterating the difficulty of detection or in Bradyrhizobium, “nif” and “nod” genes are not located on large plasmid. By culturing cells in the presence of glycine, followed by treatment with lysozyme (300ug/ml), it was possible the formation of spheroplasts and/or protoplasts in more than 90% of the cells for less than 6 hours of treatment. Cells of Rhizobium and Bradyrhizobium are naturally resistant to the lysozyme action. By using the insert ignoreional inactivation vector pUC119, a genomic bank of the total DNA from the Bradyrhizobium species has been constructed and established by transformation in E. coli HB101. The hybrid plasmids of the bank contained Bradyrhizobium DNA fragments of 10-20 kilobases insert ignoreed into “lac” z region. Mobilization of the pSUP 5011::Tn5 mob+ plasmid to R. leguminosarum biovar phaseoli C05 was effected in frequency 0,4.10-5, through the binary plasmid system, including the “trans” – complementation vector pRK2013.
 
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ValariniMariaJose.pdf (9.25 Mbytes)
Publishing Date
2021-01-07
 
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