Estabeleceu-se um sistema de transformação de plantas a partir de biolística em calos embriogênicos de dois clones nacionais de cana-de-açúcar, SP80-180 e SP82-3721. Após experimento para obtenção de quantidade suficiente de calos embriogênicos derivados de segmentos transversais de folhas jovens, foram otimizados parâmetros como distância do alvo, pressão de disparo e quantidade de DNA, em aparelho de biolística desenvolvido pelo Centro de Tecnologia Copersucar, segundo modelo descrito por FINER et.al.(1992). Para isso, calos embriogênicos foram bombardeados com o vetor pAhc27, que contém o gene repórter uid-A (gus). Análises histoquímicas com o substrato X-gluc foram realizadas para determinação dos melhores níveis de expressão. Microscopia ótica e eletrônica de varredura foram realizadas para melhor compreender a introdução das partículas nas células. Calos embriogênicos em fase R2 (resultantes de dois ciclos de seleção) foram utilizados para determinar a sensibilidade do explante ao antibiótico geneticina, que seria utilizado em meio seletivo para seleção dos transformantes. Vários experimentos de co-transformação, utilizando os plasmídios pHA9 (que contém o gene de resistência a antibióticos aminiglicosídicos, como kanamicina e geneticina) e pAHC20 (que contém o gene de resistência ao herbicida glufosinato de amônio), foram realizados com os dois clones. Após seleção de calos transformados e regeneração de plantas em meio seletivo contendo geneticina (30 mg/L),|as possíveis plantas transgênicas foram transferidas para casa de vegetação. Teste fenotípico para resistência ao antibiótico foi realizado em casas de vegetação, com aplicação do antibiótico kanamicina (1%) diretamente sobre ferimento em limbo foliar. O herbicida comercial Finale foi aplicado em duas pulverizações sobre as plantas que se mostraram resistentes ao antibiótico. As plantas resistentes foram consideradas co-transformadas. Parte das plantas co-transformadas foram submetidas a análises moleculares para confirmação da co-transformação. Hibridizações Southern foram realizadas para detectar a presença dos genes no genoma e estimar o número de cópias inseridas. Também foram analisadas plantas obtidas por micropropagação das plantas transformadas para verificar a manutenção do status transgênico. Análises de expressão dos transgenes foram realizadas por dois métodos diferentes: imunoensaio Western blot para proteína NPT-II, e RT-PCR para RNA transcrito do gene bar. O presente sistema possibilitou a obtenção de plantas transformadas de cana-de-açúcar em cerca de 200 dias e provavelmente será adaptável para introdução de outros genes de interesse agronômico que já estão sendo estudados para a cultura

A sugarcane genetic transformation system was established using embryogenic callus of two Brazilian clones: SP80-180 and SP82-3721. Embryogenic calli obtained from culture of cross sections of young leaves were bombarded to optimize parameters such as target distance, helium pressure and amount of DNA. The experiments used a biolistic apparatus developed by Copersucar Technology Center according to a model described by Finer et al. (1992). Plasmid pAHC27 was used as a vector containing the uid-A reporter gene. Histochemical analysis with X-gluc substrate were dane to investigate to determine the best expression levels. Light and scanning electron microscopy were conducted to investigate the particle insert ignoreion into cells. Embriogenic callus was used to detem,ine explant sensitivity to the antibiotic geneticin, used to select transformed tissue. Several cotransfomation experiments were dane with two sugarcane genotypes using plasmid pHA9 (containing a gene for resistance to aminoglicosidic antibiotics such as kanamycin and geneticin) and pAHC20 (containing a gene for resistance to the herbicide ammonium gluphosinate). After selection of transformed callus and plant regeneration in selective medium containing 30 mg/l geneticin, the putative transgenic plants were transfered to the greenhouse. A phenotypical test for antibiotic resistance was performed in the greenhouse with the application of a 1 % kanamycin solution on a wound made in the leaf surface. A commercial formulation of ammonium gluphosinate was sprayed twice on plants that showed resistance to the antibiotic. Resistant plants were considered to be cotransformed. Some of the cotransformed plants were submitted to molecular analysis to confirm, their transformation status. Southem blots were dane to detect the presence of the genes in the plants genome and to determine the number of copies insert ignoreed. Micropropagated transformed plants were also analyzed to determine stability of the insert ignoreions. Gene expression in the transformants was analyzed by two different methods: Westem blot for the antibiotic resistance gene and RT-PCR for the herbicide resistance gene. This system allowed the recovery of transformed sugarcane plants in 200 days and will probably allow the introduction of other genes of agronomic interest in other varieties of this important crop.