O presente estudo foi realizado como parte de uma linha de pesquisa desenvolvida no Departamento de Genética, ESALQ/USP, visando a caracterização citogenética de linhagens endogâmicas, envolvendo as metodologias de bandamento-C e hibridação molecular in situ. Foram realizados experimentos para a padronização de um protocolo para a obtenção de preparações citológicas com alto índice de metáfases de boa qualidade, com cromossomos bem espalhados e com a morfologia dos cromossomos bem nítida, utilizando-se pré-tratamento com inibidores do fuso mitótico e da síntese de proteínas. O pré-tratamento empregando uma combinação de 8- hidroxiquinolina a 0,03% e cicloheximida a 0,00125% promoveu maior acúmulo de metáfases e prometáfases em comparação ao tratamento com 8-hidroxiquinolina a 0,03%. As lâminas foram preparadas através de esmagamento das células meristemáticas após tratamento enzimático (com celulase e pectinase) da raiz e dissecção da mesma para remoção das células meristemáticas. Foi realizada uma análise biométrica dos cromossomos somáticos em preparações coradas pela metodologia de bandamento-C, de duas linhagens com diferenças em seu conteúdo de knobs heterocromáticos e respectivo híbrido. Foram constatadas novas evidências de que bandas-C correspondentes a knobs de tamanho grande ou médio (observados no paquíteno) alteram o tamanho dos braços de cromossomos somáticos, conforme observação anterior (Aguiar-Perecin & Vosa, 1985). A análise comparativa entre cromossomos mitóticos e cromossomos paquitênicos evidenciou nítida correspondência entre os valores de comprimento relativo e relação de braços para a maioria dos cromossomos, além de demonstrar claramente a correspondência entre as bandas-C e os knobs heterocromáticos. Durante o desenvolvimento do presente trabalho foi padronizado um protocolo para hibridação molecular in situ. através do método de marcação não isotópica da sonda de DNA com biotina e detecção do sinal de hibridação através de digestão enzimática, empregando-se fosfatase alcalina conjugada com avidina/ estreptavidina. Foi utilizada uma sonda da sequência de DNA altamente repetitivo de 185 pb, característica dos knobs heterocromáticos, para a investigação do padrão de distribuição destas sequências ao longo dos cromossomos. O material utilizado foi o híbrido 441123 x 4443. O sinal de hibridação da sonda de DNA de 185 pb apresentou estreita correspondência com a localização e tamanho das bandas-C. A eficiência da presente metodologia pode ser amplamente explorada para o mapeamento de diversos tipos de sequências de DNA ao longo do complemento cromossômico nesta espécie e em outras espécies vegetais.

A protocol employing mitotic fuse inhibitors is described for cytological preparations with high frequency of high quality metaphases, with well-spread chromosomes showing clear details of their morphology. A pretratment using a combination of 0,03% 8- hydroxyquinoline and 0,00125% cycloheximide promoted a better degree of metaphase and prometaphase accumulation in comparison with treatment with 0,03% 8-hydroxyquinoline. The spread were prepared by squashing the meristematic cells, after enzimatic treatment (with cellulase and pectinase) and dissection of the root and remotion of meristematic cells. Na biometric analysis of C-banded somatic chromosomes was carried out. Two inbred lines differing in their heterochromatic knobs content and respective hybrid were used. This study provided new evidences that C-bands corresponding to large and medium size knobs (observed at pachytene) alter the length of somatic chromosome arms, a shown previously (Aguiar-Perecin & Vosa, 1985). Comparation between mitotic and pachytene chromosomes provided clear evidences of correspondence between the values of relative length and arm ratio for most chromosomes, and between C-bands and knobs. Also, a protocol was developed for molecular in situ hybridization, using non-radioative DNA labelling with the biotin- streptavidin system and signal detection by enzimatic digestion. A probe of 185 pb highly repetitive DNA sequence, characteristic of knobs was used to investigation the pattern of the distribution of these sequences along the chromosomes. The material used was the hybrid 441123 x 4443. The signal of hybridization of the 185 pb sequence was correspondent to knobs sites observed in C-banded preparations. The methodology described will be useful for the mapping of different types of DNA sequences in maize chromosomes and other species, as well.