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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.1986.tde-20210104-194040
Document
Author
Full name
Sergio Echeverrigaray Laguna
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 1986
Supervisor
Title in Portuguese
Genética e melhoramento de leveduras para a biconversão de extratos de H. tuberosus L.
Keywords in Portuguese
BIOCONVERSÃO
EXTRATOS DE ALCACHOFRA JERUSALÉM
LEVEDURAS
MELHORAMENTO GENÉTICO
Abstract in Portuguese
O presente trabalho teve como principais objetivos estabelecer quais as leveduras mais adequadas a fermentação alcoólica e à produção de xaropes de frutose, a partir de inulina de extrato de tubérculos de H. tuberosus. Para tanto foram desenvolvidos experimentos de seleção de leveduras, avaliação da atividade inulinolítica extracelular, estudo de parâmetros cinéticos e estudos genéticos importantes para o melhoramento destes organismos. A seleção de leveduras permitiu estabelecer que as espécies mais adequadas à fermentação de extratos de H. tuberosus são K. marxianus, K. fragilis e C. pseudotropicalis. Com leveduras selecionadas foi possível desenvolver fermentações de 12 horas com 9,87°GL de etanol e rendimentos de 96,56%, com produtividade volumétrica de 7,87 g.l-1.h -1 e produtividade de específica de 2,35.g. g-1.h -1, o que torna o processo de fermentação deste substrato comparável com as fermentações de cana-de-açúcar. As linhagens testadas de K. marxianus, K. fragilis e C. pseudotropicalis exibiram altas atividades inulinolíticas extracelulares, o mesmo não ocorrendo nas linhagens de S. cerevisiae, C. guillemondii e T. colliculosa, nas quais não foi possível detectar atividade extracelular desta enzima. Os dados obtidos mostraram que a inulinase extracelular de K. marxianus não apresenta repressão catabólica, e a sua síntese mesmo sendo constitutiva foi estimulada por inulina, sacarose e celobiose. Por outro lado, a inulinase extracelular de K. fragilis sofre repressão catabólica e retroinibição em concentrações de açúcares redutores superiores a 3x10-3M, sendo a sua síntese induzida por inulina e por ?-fructosídios (incluindo sacarose). Observou-se adicionalmente que os extratos enzimáticos de Kluyveromyces, apresentam dois pH ótimos (p H 4,0·e 7,0) de atividade inulinolítica , e são sensíveis a temperaturas superiores a 50°C. Dentre as linhagens testadas, três de K. marxianus exibiram caráter “killer” a pH 4,5, sendo a sua toxina muito ativa sobre leveduras do gênero Saccharomyces, mas não sobre o próprio gênero. O caráter “killer” nestas leveduras está associado à presença de dois plasmídios de DNA (pM1 e pM2) e a resistência à própria toxina deve-se a genes nucleares. Sendo a toxina muito eficiente no controle de contaminantes de Saccharomycesdurante a multiplicação, está levedura pode vir a ser usada onde a presença destas leveduras não for desejada. As linhagens de K. marxianus não exibe reação sexual definida e as taxas de hibridização foram muito reduzidas, tanto em cruzamentos intra, como interespecíficos. Es te aspecto não foi limitante para os estudos genéticos, permitindo a identificação de dois genes inulinolíticos designados lnl1 e lnl2, presentes respectivamente em IZ 1339 e IZ 619. Estes genes estão ligados a 10 cm, e quando os alelos lnl1 e lnl2, estão presentes na mesma linhagem ocorre interação que resulta em atividades muito superiores aos genes individuais. A variação entre segregantes de híbridos de K. marxianus mostrou-se significativa, sendo obtidos segregantes com capacidade fermentativa superior aos parentais e as linhagens selecionadas. As técnicas recombinogênicas empregadas mostraram-se eficientes e este resultado mostra o grande potencial de resposta de métodos que envolvem a recombinação nestas leveduras. Mesmo os métodos não convencionais de cruzamento mostraram-se viáveis, sendo os produtos de fusão entre K. marxianus e K. lactis estáveis, produzindo ascos com esporos reniformes, porém com baixa viabilidade. Estes produtos de fusão apresentaram boa capacidade de fermentação de glicose, extratos de H. tuberosus lactose, exibindo também o caráter “killer” do parental K. marxianus Os resultados permitem concluir que a fermentação de extratos de H. tuberosus e a produção de enzimas inulinolíticas por apresentarem produtividades e rendimentos elevados que possibilitam a produção econômica de etanol e xarope de frutose via hidrólise enzimática a partir deste vegetal. Através do melhoramento das leveduras do gênero Kluyveromyces e da produção agrícola de H. tuberosus, estes processos podem ser mais econômicos e portanto com maior potencial de competição com outras tecnologias existentes.
Title in English
Genetics and improvement of veasts for the bioconvertion of H. tuberosus L. extracts
Keywords in English

Abstract in English
This work had the main objectives of selection of suitable yeasts for fermen tation.and enzyme production for inulin hydrolysis. Both properties are required to use H. tuberosus (Jerusalem Artichoke) extracts to obtain ethanol and fructose syrups. Kinetic parameters of fermentation and enzyme activities were studied and some genetics of Kluyveromyces yeasts developed as well as the breeding and selection of promising lines. Among different yeasts tested, K. marxianus, K. fragilis and C. pseudotropicalis were considered to be adequate for H. tuberosus extracts fermentation. Fermentations were achived in 12 hours with selected yeasts and 9,87°GL of ethanol production.and a yield of 96,56%. Volumetric productivity reached 7,87 g.l-1.h -1 and the specific productivity of 2,35.g. g-1.h -1. The yeasts Saccharomyces cerevisiae, Candida guillemondii and Torulopsis colliculosa, do not show extra-celular inulinase production but high levels of enzyme activity were found for K. marxianus, K. fragilis and C. pseudotropicalis The extracelular inulinase of K. marxianus, has not presented catabol ic repressionar i d synthesis appeared to be constitutive, but stimulated by inul in, sucrose and cellobiose. On the other hand, the extracelular inulinase of K. fragilis presented catabol ic repression and possibly innactivation at concentrations above 3x10-3M of reduzing sugars. Synthesis was induced by inul in or other ?-fructosídios including sucrose. ln addition it was observed that Kluyveromyces extracelular enzymatic extracts show two peaks of inul inolytic activity, one at pH 4.0 and the other at pH 7.0, and activity was ceased in temperatures above 50°C. Among the yeasts tested two strains of K. marxianus presented the killer character at pH 4.5 with a very active toxin against Saccharomyces yeasts but not to other Kluyveromyces This kil ler character was determined by the presence of two DNA plasmids (pM1 e pM2) and toxfn resistance was proved to be of nuclear nature. Considering the toxin very efficient against Saccharomyces contaminant yeasts during multiplication this ability could .be of interest in fermentations where the presence of Saccharomyces is undesired. The strains of Kluyveromyces did not exibited mating type reaction and hybridization rates were very low in both intra and interespecific crosses. This aspects was not limitant· for the genetic studies and it was possible to identify two genes for inulin utilization designed lnl1and lnl2, which were present respectively in the strains IZ 1339 and IZ 619. The genes are linked at about 10 cM and when both are presented intereaction is observed leaging to enhanced inulinase activity. Variation among segregant strains from the hybrids of K. marxianus was significant and superior strains were obtained compareci to the parental selected lines. The recombinogenic methods have shown to be efficient and such results are an evidence of the great resppnse potential of this methods. Even non conventional methods of intercrossing have shown to be viable. Fusion products among K. marxianus and K. lactis were stable and sporulated. However the spore viability was very low. The fúsion hybrids show good mentation ability of glucose, H. tuberosus extracts and lactose, and show the killer character of the parental K. marxianus strain. The results obtained support the conclusion that H. tuberosus fermentation and the production of inulinolitic enzymes, due to its high productivity and yields, make possiblw the economic production of ethanol and fructose syrups via enzymatic hydrolisis. Consldering the by the breeding of Kluyveromyces yeasts and better agricultural production of H. tuberosus the process could ·be more economical and competitive with other existent technologies.
 
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Publishing Date
2021-01-07
 
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