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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.11.1999.tde-20210104-194445
Document
Author
Full name
Vera Maria Quecini
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 1999
Supervisor
Title in Portuguese
Transferência direta de genes para plantas de Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw.
Keywords in Portuguese
ESTILOSANTE
TRANSFERÊNCIA DE GENES
Abstract in Portuguese
O presente trabalho teve por objetivo otimizar as condições físicas, químicas e biológicas envolvidas na transformação direta de plantas de Stylosanthes guianensis cv. Mineirão, uma leguminosa forrageira tropical. Foram estudadas a transformação genética por bombardeamento de micropartículas e por eletroporação de tecidos íntegros e protoplastos visando à introdução de um gene quimérico que codifica a albumina 2S do castanheiro do Pará (Bertholletia excelsa) dirigido pelo promotor atsl A da subunidade menor da rubisco de Arabidopsis thaliana, restringindo a expressão a tecidos clorofilados. A fonte de explante, a pressão de gás hélio, a distância de vôo das micropartículas, a distância entre o gerador de onda de choque até a tela de retenção e distância de vôo da membrana macrocarreadora foram os parâmetros avaliados na transformação por biobalística. A análise da expressão transiente do gene repórter uid A foi usada para verificar a eficiência de transformação nos explantes bombardeados. Calos organogênicos 30 a 45 dias após a indução foram os explantes que promoveram níveis mais elevados de expressão transiente. As frequências mais elevadas de transformação foram observadas utilizando-se : 1200 psi de gás hélio, 12, 5 cm de distância de vôo dos microprojéteis, 10 a 20 mm de distância entre a membrana macrocarreadora e a tela de retenção e 1o a 20 mm de distância entre a membrana de ruptura e o macrocarreador. A eficiência de transformação por eletroporação de tecidos intactos foi igualmente avaliada pela expressão de GUS. A fonte de explante e a intensidade do campo elétrico foram os fatores que tiveram influência mais decisiva sobre a eficiência de transformação, sendo que o melhor explante foi cotilédone e campos elétricos de 100 a 250 V.cm -1 promoveram alta frequência de explantes GUS positivo. O uso de tampão de eletroporação sem íons cloreto, de DNA plasmidial linearizado e o pré-tratamento dos explantes com 1,6 M de manitol como agente osmótico aumentaram, porém de forma não significativa, a expressão de GUS. O gene mgfp 5, que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) foi empregado como repórter in vivo para a eletroporação de protoplastos de S. guianensis. Capacitores de 1000 µF descarregando campos elétricos de 100 a 250 m. V-1 à suspensão de protoplastos em tampão sem íons cloreto promoveram níveis mais altos de expressão transiente de GFP. O uso de DNA plasmidial linearizado também promoveu um aumento na eficiência de transformação. Transformantes estáveis de S. guianensis cv. Mineirão foram obtidos via eletroporação de protoplastos e biobalística. A eficiência de transformação, de 3,47 % e 36 % para biobalística e eletroporação de protoplastos, respectivamente, pode ser considerada elevada quando comparada aos valores relatados para a transformação de leguminosas. A inserção estável do transgene foi confirmada por hibridização de ácidos nucléicos utilizando sonda específica para a unidade de transcrição na planta do vetor de transformação pEA ats:2S. A expressão do transgene foi confirmada pela detecção de transcritos do BE2S1 por análise de Northern blot e por imunodetecção da proteína 2S em tecidos foliares de estilosantes. Há evidências de que a albumina 2S de B. excelsa é corretamente processada e transportada para corpos protéicos de armazenamento em folhas de plantas transgênicas de S. guianensis.
Title in English
Direct gene transfer to plants of Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw.
Keywords in English

Abstract in English
The main objective of the present work was to optimize physical, chemical and biological parameters involved in direct gene transfer to Stylosanthes guianensis cv. Mineirão plants, a tropical forage legume. Microparticle bombardment, intact tissue and protoplast electroporation were assayed in order to transfer a methionine-rich 2S albumin gene from Brazil nut (Bertholletia excelsa) driven by rubisco small subunit gene promoter atsl A from Arabidopsis thaliana, inducing chlorophyll-biosynthesis dependent-expression. Explant source, helium pressure, microparticles flight distance, distance between shock wave generator and macrocarrier and gap distance between macrocarrier and stop screen were the parameters evaluated for biolistic transformation. Transient reporter gene uid A expression was used to test transformation efficiency. Organogenic calli 30 a 45 days after induction were the explants that promoted higher levels of transient expression. The highest transformation levels were found employing : 1200 psi of helium pressure, 12.5 cm microprojectiles flight distance, 10 to 20 mm distance between macrocarrier membrane and stopping screen and, 10 to 20 mm gap distance between shock wave generator and macrocarrier. Intact tissue electroporation was also evaluated employing the GUS system. Explant source and electric field strength were the parameters that had greater influence on transformation efficiency. Cotyledons and electric field strength of 100 to 250 V.cm-1 promoted higher frequencies of GUS positive explants. Electroporation buffers Iacking chloride ions, linear plasmid DNA and 1.6 M mannitol pretreatment increased GUS expression, but non-significantly. The gene mgfp 5, coding for green fluorescent protein (GFP) was utilized as in vivo reporter in S. guianensis protoplast electroporation. Capacitors of 1000 µF discharging 100 to 250 m.V-1 electric fields to protoplast suspension in chloride-free electroporation buffers promoted higher GFP expression. Linear plasmid DNA also contributed to higher transformation efficiencies. Stable transformants of S. guianensis cv. Mineirão were obtained from electroporation and biolistic transformation employing the fore mentioned conditions. Transformation frequencies, of 3.47 % and 36.00 % for biolistics and protoplast electroporation respectively, were considered high when compared to reported values of transformation efficiency for legumes in general. Stable transgene insert ignoreion was confirmed by Southem blot utilizing a plant transcription unit specific probe from transformation vector pEA ats:2S. Transgene expression was assessed by detection of BE2S1 transcripts by Northem blot and by 2S albumin immunological detection in leaf tissues from Stylosanthes. There are evidences that B. excelsa 2S albumin is correctly processed and transported to storage protein bodies in the leaves of transgenic S. guianensis plants.
 
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Publishing Date
2021-01-07
 
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