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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.11.2006.tde-21062006-111717
Document
Auteur
Nom complet
Alexander de Andrade
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2006
Directeur
Jury
Labate, Carlos Alberto (Président)
Carrer, Helaine
Gozzo, Fábio Cesar
Lambais, Marcio Rodrigues
Machado, Marcos Antonio
Titre en portugais
Sequenciamento, identificação e análise de proteínas do caule de mudas de Eucalyptus grandis
Mots-clés en portugais
caule
eletroforese
espectrometria de massas
eucalipto
madeira
proteínas
Resumé en portugais
Apesar da importância econômica e ambiental que a madeira representa como fonte natural e renovável de energia e fibras, pouco é conhecido sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos envolvidos com a sua formação. Usando metodologias proteômicas como 2D-PAGE e espectrometria de massas foi iniciada a análise do proteoma do caule de Eucalyptus grandis em diferentes estádios de desenvolvimento (5 meses, 3 anos e 6 anos). O presente trabalho baseou-se especificamente na idade de cinco meses. As plantas tiveram suas folhas, raízes e cascas removidas e seus caules foram macerados em almofariz com nitrogênio líquido e as proteínas extraídas pelo método de extração fenólica. As proteínas foram separadas por eletroforese bidimensional em fitas IPG com gradiente de pH imobilizado linear de 4-7 na primeira dimensão e gel de poliacrilamida (12,5%) na segunda dimensão. A coloração dos géis foi realizada com coomassie G250. Foram detectados 438 spots e um total de 168 spots foram retirados do gel, digeridos com tripsina e submetidos ao sequenciamento por espectrometria de massas através do sistema LCMS/ MS. O sequenciamento por MS apresentou uma eficiência de 72,02% possibilitando a identificação de 121 spots, enquanto que 35 (20,83%) não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas 22 foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência e eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducional, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. Entre os spots analisados, 22,02% estão relacionados com a produção de energia, (17,86%) metabolismo, (13,69%) processes celulares, (0,60%) transporte, (8,33%) componentes estruturais, (5,36%) metabolismo macromolecular, (4,17%) proteínas putativas, (20,83%) não apresentaram homologia com nenhuma base de dados e (7,14%) não demonstraram resultado. A comparação realizada entre o volume de 59 proteínas e os seus respectivos transcritos demonstrou que não existe correlação entre mRNA e as proteínas do caule. O método possibilitou uma rápida e precisa separação e identificação das proteínas do caule de Eucalyptus grandis que são diferencialmente expressas durante a fase de crescimento de cinco meses.
Titre en anglais
Sequencing, identification and analysis of juvenile Eucalyptus grandis xylem proteins
Mots-clés en anglais
eucalyptus grandis
mass spectrometry
two dimensional electrophoresis
wood
xylogenesis
Resumé en anglais
The process of wood formation is an important economical factor for the forestry industry and it is also of ecological importance, although little is known about the proteins involved in wood formation. The sequencing, identification and analysis of proteins provides such information of wood formation. Using proteomics techniques such as two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry we have started a proteomic analysis of wood formation in Eucalyptus grandis at different stages of development (5 months, 3 and 6 years old). This work presents data related to the stage of 5 months. Using high resolution 2DE with linear pH gradient ranging from 4 to 7, a total of 438 spots were detected. However, only 168 spots were analyzed by LC ESIMS/ MS and 121 were identified (72.02%) while 35 (20.83%) presented no homology in the database used. Overall, 22 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the proteins found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. Over the 168 spots analysed, (22.02%) play a role in energy, (17.86%) metabolism, (13.69%) cellular processes, (0.60%) transport, (8.33%) structural components, (5.36%) macromolecular metabolism, (4.17%) putative protein, (20.83%) no homology and (7.14%) no result. For 59 proteins, the spot volume was compared with their respective transcript with mRNAs extracted from wood forming tissue. The method provided a faster and accurate tool for separation and identify of protein which are differentially expressed under different stages of development in Eucalyptus grandis.
 
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AlexanderAndrade.pdf (2.09 Mbytes)
Date de Publication
2006-07-11
 
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