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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.11.2002.tde-23102002-174613
Document
Author
Full name
Esteban Roberto González
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2002
Supervisor
Committee
Labate, Carlos Alberto (President)
Floh, Eny Iochevet Segal
Goldman, Maria Helena de Souza
Goncalves, Antonio Natal
Mourao Filho, Francisco de Assis Alves
Title in Portuguese
Transformação genética de Eucalyptus grandis e do híbrido E. grandis x E. urophylla via Agrobacterium.
Keywords in Portuguese
eucalipto
melhoramento genético vegetal
morfologia vegetal
planta transgênica
sementes-transformação
Abstract in Portuguese
A produção de papel e celulose representa um importante componente do setor industrial brasileiro, com perspectivas a expandir-se nos próximos anos, sendo o Brasil o principal produtor de celulose a partir de eucalipto. A técnica de transformação genética pode contribuir significativamente para introduzir caracteres de interesse econômico que permitam: aumentar a produtividade da cultura, resistência a doenças e melhorar a qualidade da madeira. Os sistemas de transformação genética requerem um sistema de regeneração de plantasin vitro eficiente associado a um sistema de integração estável do transgene ao genoma das mesmas. Por este motivo o trabalho foi dividido em duas etapas. A primeira parte foi orientada para o desenvolvimento de um sistema de regeneração eficiente e reproduzível por organogênese indireta tanto para E. grandis como para o híbrido E. grandis x E. urophylla. Foram realizados experimentos para avaliar-se o efeito dos diferentes tipos de explantes, genótipos, concentrações de reguladores de crescimento e taxa regenerativa de diferentes clones. A regeneração de cotilédones e folhas de plântulas apresentou uma eficiência de 30 % e 25 respectivamente. Além destes sistemas, o protocolo de regeneração a partir de folhas de clones comerciais de E. grandis mostrou-se bastante eficiente. Na segunda parte do trabalho desenvolveu-se a metodologia de transformação genética de E. grandis e E. grandis x E. urophylla, via Agrobacterium tumefaciens. O efeito de diferentes tempos de pré-cultivo dos explantes, tempo de sonicação, influência dos meios de co-cultivo e dos agentes seletivos, foram avaliados. As sementes pré-cultivadas durante 2 e 15 dias apresentaram as maiores porcentagens de expressão da???? -glucuronidase (GUS) (21,7 e 37,4 %, respectivamente), quando sonicadas. As sementes pré-cultivadas por 2 dias apresentaram mais de 90 % das áreas transformadas localizadas nos cotilédones e no colo. Já as sementes pré-tratadas por 15 e 17 dias apresentaram 60 % das áreas de transformação localizadas no primeiro par de folhas. A condição mais adequada para a transformação de cotilédones foi a sonicação por 120 s, de sementes pré-cultivadas por 2 dias, sendo o melhor meio de co-cultivo o MS. Plantas transgênicas de E. grandis e E. grandis x E. urophylla foram obtidas, abrindo assim uma grande perspectiva na área de melhoramento do eucalipto, com a introdução das técnicas de transformação gênica.
Title in English
Genetic transformation of Eucalyptus grandis and of the hybrid E. grandis x E. urophylla via agrobacterium.
Keywords in English
eucalyptus
plant breeding
plant morphology
seeds-transformation
transgenic plant
Abstract in English
The pulp and paper industry is an important sector of Brazilian industry, showing good perspectives of expansion, once Brazil is the main cellulose producer from Eucalyptus. Genetic transformation may contribute to increase productivity by the introduction of desirable traits, such as pest resistance and improvement of wood quality. However, the prerequisite for the success of the transformation strategy is the establishment of an efficient, in vitro, regeneration system. The recovery of transgenic plants is only possible from cells that respond to both processes: the integration of the transgene and also the plant regeneration. Hence, this work was divided in two phases. The first study was carried out to develop an efficient and reproducible regeneration system by indirect organogenesis of E. grandis and the hybrid E. grandis x E. urophylla. The experiments were organized to evaluate the effect of the different seedling explants, genotypes, hormonal concentration and regenerative rate of clonal material. The regeneration efficiency of cotyledons and leaves of seedling explants was around 30 % and 25 %, respectively. In addition, an efficient regeneration protocol of Eucalyptus grandis was developed which uses leaf explants from clonal plants. In the second study the procedure for genetic transformation of E. grandis and E. grandis X E. urophylla using Agrobacterium is described. Several experimental parameters were evaluated such as the length of precultivation, the sonication effect, the cocultivation media and the selective agents. Germinating seeds of 2 and 15 days had the highest percentage of ? -glucuronidase (GUS) expression (21.7% and 37.4%, respectively), when sonicated. Germinating seeds imbibed for 2 days showed over 90% of the blue sectors localized in cotyledons and in the intersection of the hypocotyls and roots, whereas, seedlings that had germinated for 15-17 days had an average of 60% of the transformed sectors localized in the first pair of leaves. The best condition for an efficient genetic transformation was 2-day precultivation, associated with 120-s sonication and MS media for cocultivation. Transgenic plants of E. grandis and E. grandis x E. urophylla were obtained by this method, opening an important perspective for the breeding of Eucalyptus through genetic transformation techniques.
 
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Publishing Date
2002-10-28
 
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