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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-105716
Documento
Autor
Nome completo
Gustavo Henrique Goldman
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 1988
Orientador
Título em português
Estudos genéticos e produção de celulase em Aspergillus niger
Palavras-chave em português
ENZIMAS CELULOLÍTICAS
FUNGOS
GENÉTICA MICROBIANA
Resumo em português
Neste trabalho foram realizados estudos genéticos e verificada a produção de celulase na linhagem industrial, produtora de amilase, de Aspergillus niger NRRL-337, com os seguintes objetivos: isolamento de mutantes auxotróficos e morfológicos nesta Linhagem; verificação da ocorrência do ciclo parassexual; definição de um protocolo eficiente para o isolamento e a regeneração de protoplastos, e, determinação da atividade celulolítica em comparação com o mutante hipercelulolítico Trichoderma reesei QM 9414. Todos os objetivos acima enumerados visaram fornecer subsídios para posteriores estudos da genética básica, bem como para o estabelecimento de um programa de melhoramento genético nesta linhagem. Foram feitas curvas de sobrevivência dos conídios de A. niger para a radiação gama, a luz ultravioleta, o ácido nitroso e o dietilsulfato. Através da irradiação com raios gama foram obtidos sete mutantes morfológicos, onze auxotróficos simples e quinze auxotróficos com dupla deficiência. O rendimento obtido no isolamento total de mutantes auxotróficos foi de 0,52 %, enquanto que no enriquecimento por filtração foi de 2,0 a 4,8 vezes maior. A partir do teste de reversão realizado, verificou-se que os mutantes auxotróficos obtidos demonstraram uma alta estabilidade genética. Com as marcas auxotróficas e morfológicas isoladas, foram feitas tentativas de cruzamento. Obtiveram-se películas heterocarióticas em todos os cruzamentos realizados. Através de diversas metodologias (medição do tamanho de conídios, crescimento em benlate e eletroforese em gel de poliacrilamida com revelação especifica para esterases), não foi possível a definição da ocorrência de diplóides. O protocolo mais eficiente para o isolamento de protoplastos foi obtido a partir da protoplastização do micélio, usando como estabilizador osmótico KCl 0,6 M. Em relação a regeneração, a melhor percentagem foi obtida a partir da protoplastização de tubos germinativos, usando no isolamento como estabilizador osmótico MgSO4 0,5 M e na regeneração MgSO4 0,5 M e Sorbitol 1,2 M. Com o uso de micélio, o número de núcleos por protoplasto não foi superior a dez (com o estabilizador osmótico KCl) ou foi próximo ou superior a dez (com o estabilizador osmótico MgSO4). Os protoplastos isolados a partir do micélio com KCl 0,6 M e armazenados com este mesmo estabilizador a 4°C, apresentaram uma viabilidade de 60 % após 6 dias de armazenamento. A. niger apresentou atividades de beta-glicosidase, carboximetilcelulase, avicelase e papel de filtro modificado similares a da linhagem T. reesei QM 9414. A partir de uma eletroforese em gel de poliacrilamida, com revelação especifica para celulases, constatou-se que a abundância relativa da celulase produzida pela primeira espécie era similar a do mutante celulolítico.
Título em inglês
Genetic studies and cellulase production by Aspergillus niger
Resumo em inglês
In the present study, the amylase-producing industrial strain of Aspergillus niger NRRL-337 was studied genetically and for cellulase production with the following objectives: isolation of auxotrophic and morphological mutants of this strain; determination of the occurrence of the parassexual cycle; definition of an efficient protocol for the isolation and regeneration of protoplasts, and determination of cellulolytic activity in comparison with the hypercellulolytic mutant Trichoderma reesei QM 9414. By fulfilling the above objectives we intended to contribute to the study of basic genetics and to the establishment of a genetic improvement program for this strain. Survival curves were obtained for A. niger conidia exposed to gamma radiation, UV light, nitrous acid, and diethylsulfate. Seven morphological mutants, eleven simple auxotrophic mutants and fifteen double-deficient auxotrophs were obtained by gamma irradiation. The yield of total isolation of auxotrophic mutants was 0.52%, while the yield obtained by enrichment through filtration was 2.0 to 4.8 times higher. A reversion test showed that the auxotrophic mutants obtained had high genetic stability. Crosses were attempted with the auxotrophic and morphological markers isolated. Heterokaryotic mats were obtained in all crosses performed. Several methods used (measurement of conidial size, growth on benlate and polyacrilamide gel electrophoresis specific for esterases) did not permit the definition of the occurrence of diploids. The most efficient protocol for protoplast isolation was obtained from protoplastization of mycelium using 0.6 M KCl as osmotic stabilizer. The best percentage of regeneration was obtained from protoplastization of germinative tubes, using 0.5 M MgSO4 as stabilizer in the isolation, and 0.5 M MgSO4 or 1.2 M Sorbitol in the regeneration. When mycelium was used, the number of nuclei per protoplast did not exceed ten (with the osmotic stabilizer KCl) or was close to or higher than ten (with the osmotic stabilizer MgSO4). Protoplasts isolated from mycelium with 0.6 M KCl and stored at 4°C with the same stabilizer showed 60% viability after 6 days of storage. A. niger showed beta-glucosidase, carboxymethylcellulase, avicelase, and modification of filter paper assay similar to those of the strain T. reesei QM 9414. Polyacrilamide gel electrophoresis specific for cellulases showed that the relative abundance of cellulase produced by this species was similar to that of the cellulolytic mutant.
 
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Data de Publicação
2019-12-19
 
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