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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-161115
Document
Auteur
Nom complet
Valeria Siessere
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 1991
Directeur
Titre en portugais
Otimização das condições de cultivo para produção e caracterização parcial das enzimas pectinolíticas de Penicillium frequentans
Mots-clés en portugais
ENZIMAS PECTINOLÍTICAS
FUNGOS
Resumé en portugais
O complexo pectinolítico é composto por enzimas que degradam substâncias pécticas. Vários microrganismos produzem essas enzimas, mas para fins industriais, principalmente na clarificação de sucos de frutas, somente as de origem fúngica são utilizadas. Os objetivos deste estudo foram adequar as condições de cultivo para produção de enzimas pectinolíticas por Penicillium frequentans, e caracterizá-las parcialmente. A atividade pectinolítica presente nos filtrados das culturas foi avaliada, principalmente, por diminuição da viscosidade e por liberação de açúcar redutor de uma solução contendo como substrato, pectina ou ácido poligalacturônico. A melhor concentração de pectina para induzir a síntese do complexo pectinolítico era 0,5% e com valores maiores observou-se uma redução nos níveis enzimáticos, provavelmente devido à repressão catabólica. O pH inicial do meio de cultivo também influenciou a produção de enzimas pectinolíticas por este microrganismo. Nos intervalos de pH 2,0 - 2,5 e 7,0 - 8,0 obteve-se os maiores níveis enzimáticos, mas enquanto no primeiro detectou-se atividade diminuidora da viscosidade e liberadora de açúcar redutor, no segundo havia também a atividade de pectina liase. A concentração de inóculo mais adequada para produção de enzimas pectinolíticas em 20 horas de incubação era 5.107 esporos/ml de meio de cultivo. Esporos obtidos de culturas com 10 dias apresentaram melhores resultados, e a melhor temperatura era 30 - 35°C. Combinando-se todas essas condições, ajustando o pH inicial em 2,5 e mantendo-se a cultura sob agitacão constante, detectou-se que os níveis enzimáticos aumentaram até a 17ª hora de cultivo. Quando a cultura era mantida sem agitação, os maiores níveis enzimáticos foram obtidos na 48ª hora. As enzimas produzidas em cultura agitada mostraram-se bastante resistentes ao pH (2,6 - 8,2) e à temperatura (40°C). Determinou-se que as condições ótimas de reação eram em pH 2,6 a 6,0 e nas temperaturas entre 50 e 55°C, quando o substrato era pectina. Os melhores indutores das enzimas pectinolíticas produzidas por Penicillium frequentans foram pectina cítrica, ácido poligalacturônico, "citrus pulp pellets" e ácido monogalacturônico, nesta ordem. Observou- se também que a presença de glicose em concentrações iguais ou superiores a 0,8%, produzia o "efeito glicose", provavelmente por repressão catabólica. As enzimas pectinoliticas assim produzidas foram separadas e parcialmente caracterizadas quanto ao seu mecanismo de ação e substrato preferido. Através de cromatografia de troca iônica em colunas de DEAE-Sephacel e CM-Celulose separou-se seis picos enzimáticos com atividade depolimerizante, três dos quais apresentaram atividade do tipo endo e os outros restantes apresentaram caráter exo. Polipectato de sódio era o substrato preferido para as enzimas de todos os picos. Atividade pectinesterase foi detectada nas frações mas não foi adequadamente separada por esse processo cromatográfico. Esses resultados permitem-nos concluir que o fungo Penicillium frequentans produz, nas condições estabelecidas, pelo menos três endopoligalacturonases, três exopoligalacturonases e pectinesterase.
Titre en anglais
Optimization of culture conditions for production and parcial characterization of Penicillium frequentans pectinolytic enzymes
Resumé en anglais
The pectinolytic complex is composed by enzymes which degrade pectic substances. Several microorganisms produce these enzymes, but to industrial purposes, mainly in fruit juice clarification, only the fungi enzymes are used. The objectives of this study were to make suitable the culture conditions for pectinolytic enzymes production by Penicillium frequentans and to characterize partially them. The pectinolytic activity present in culture filtrate was mainly measured by viscosity-diminishing activity and reducing sugar-releasing activity with pectin or polygalacturonic acid solutions as substrates. The best pectin concentration to induce pectinolytic complex synthesis was 0,5% and at higher values it was found enzymatic levels reduction, likely due to catabolic repression. Initial pH of the culture medium also influenced the pectinolytic enzymes production by this microorganism. The highest enzymatic levels were obtained at two differents range of pH (2,0 - 2,5 and 7,0 - 8,0), as measured by viscosity-diminishing activity and reducing sugar-releasing activity. In the second range, there was also found the pectin lyase activity. Suitable inoculum concentration for pectinolytic enzymes production, for 20 hours incubation, was 5.107 spores/ml of the culture medium. Spores derived from 10 days old cultures presented the best results and the ideal temperature was 30 - 35°C. Using the determined conditions, the fungus was grown in a medium with the pH 2,5 and keeping constant agitation. By this way, the enzymatic levels increased until the 17ª hour of culture. In absense of agitation, this increase was observed only at the 48ª hour. Enzymes produced in agitated cultures showed resistance to pH (2,8 - 8,2) and to temperature (40°C). Ideal reaction conditions were at pH 2,6 – 6,0 and temperature between 50 and 55°C, when substrate was pectin. In order of effectiveness, the best inducers of pectinolytic enzymes produced by Penicillium frequentans were citric pectin, polygalacturonic acid, citrus pulp pellets and monogalacturonic acid. The "glucose effect" was verified when the glucose concentrations was 0,8% or more, likely by catabolic repression. The pectinolytic enzymes produced in this way were separated and partially characterized by their action mechanism and preferred substrate. Six enzymatic peaks with depolymerizing activity were separated by ion-exchange chromathography using DEAE-Sephacel and CM-Celulose columns. Three of them presented endo activity and the others had exo character. The sodium polypectate was found to be the preferred substrate for all the separated enzymes. The pectinesterase activity was observed in fractions but wasn't suitably shared by this separation process. These results show us that Penicillium frequentans was able to produce, at least three endopolygalacturonase, three exopolygalacturonase and pectinesterase enzymes, in our established conditions.
 
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SiessereValeria.pdf (5.63 Mbytes)
Date de Publication
2019-12-19
 
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