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Master's Dissertation
DOI
Document
Author
Full name
Elaine Cristina Castelhano-Barbosa
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2001
Supervisor
Title in Portuguese
Estudo da expressão espacial e temporal do gene da miostatina durante o desenvolvimento embrionário de galinha (Gallus gallus)
Keywords in Portuguese
DESENVOLVIMENTO
EMBRIÕES
EXPRESSÃO GÊNICA
GALINHA
HIBRIDIZAÇÃO
MIOSTATINA
TRANSCRIÇÃO REVERSA-REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE
Abstract in Portuguese
O padrão de expressão temporal e espacial do gene da miostatina foi investigado em embriões de galinha em 12 diferentes estádios do desenvolvimento e também nos tecidos hepático e muscular esquelético de uma ave jovem com a utilização das técnicas de RT-PCR (transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase) e hibridização in situ. Ovos recém postos foram incubados e embriões de galinha foram coletados e estadiados de acordo com sua fase de desenvolvimento. Amostras de RNA total foram extraídas dos embriões e tecidos mencionados acima e a partir destas foi realizada a síntese de cDNA, o qual foi utilizado nas reações de PCR com "primers" específicos a um fragmento do gene da miostatina de galinha. Embriões nos estádios HH20 e HH24 foram submetidos à hibridização in situ com sondas de RNA senso e antisenso específicas à miostatina, digoxigenina-marcadas. Visando uma determinação precisa do local de expressão da miostatina, também foram realizados cortes histológicos nos embriões hibridizados. Os resultados da RT-PCR revelaram que houve expressão do gene da miostatina em todos os estádios estudados, desde HH1 (ovo recém posto) até HH26 (5 dias) e também no tecido muscular esquelético de um frango com 14 dias, não sendo detectada expressão deste gene no tecido hepático. Além disso, foi possível identificar por esta técnica a presença de um transcrito alternativo deste gene. Análises em programas de computador específicos para este fim indicaram que a tradução deste produto alternativo geraria uma proteína truncada pela adição de um códon de terminação precoce na posição 129 da cadeia de aminoácidos. Para determinar as prováveis causas da presença deste transcrito alternativo, o intron 1, situado entre os sítios de ancoragem dos "primers" utilizados, foi sequenciado e a sua sequência foi analisada e submetida ao GenBank (gi|9739164). Nenhuma alteração foi encontrada nos sítios de processamento do intron 1, sendo ) mantido o padrão GT-AG. As análises de hibridização in situ permitiram a visualização de sinais da expressão da miostatina nos somitos dos embriões hibridizados. Embriões mais jovens (HH20) apresentaram um sinal menos intenso quando comparados com embriões mais desenvolvidos (HH24) e este sinal iniciou-se na região distal com relação ao complexo tubo neural/notocorda, abrangendo uma porção maior dos somitos em embriões mais desenvolvidos. Cortes histológicos transversais dos embriões hibridizados demonstraram que a expressão da miostatina ocorre no miótomo dos somitos
Title in English
Spatial and temporal myostatin gene expression during chicken (Gallus gallus) embryonic development
Abstract in English
The temporal and spatial myostatin gene expression patterns were studied in chicken embryos at 12 different developmental stages and in hepatic and muscular tissues of a young chicken by RT -PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) and by whole mount in situ hybridization techniques. Fertilized eggs were incubated, and the chicken embryos were collected and assorted according to their developmental stage. Total RNA samples were extracted from the embryos and the above mentioned tissues. These samples were used as templates for cDNA synthesis, which was applied in PCR reactions with specific primers for chicken myostatin. Stage HH20 and HH24 embryos were submitted to whole mount in situ hybridization with myostatin specific sense and antisense DIG-Iabelled RNA probes. To accurately localize the myostatin expression region, embryos were submitted to histological sections. The RT-PCR results showed that myostatin was expressed in all stages studied, from HH1 (unincubated embryos) to HH26 (5-day-old embryos) as well as in skeletal muscle tissue from a 14-day-old chicken. Myostatin expresion was not detected in hepatic tissue. Moreover, this technique allowed the detection of an alternative transcript of this gene. Analyses using specific softwares indicate that translation of this alternative product would lead to a truncated protein caused by a precocious terminator codon at position 129 of the aminoacid chain. With the purpose of detecting the possible causes leading to the formation of the alternative product, intron 1, situated between the primer recognition sites, was sequenced and submitted to the GenBank (giI9739164). Alterations were not found at intron 1 splicing sites, which followed the GT-AG rule. With whole mount in situ hybridization analyses it was possible to visualize signs of myostatin expression in chicken somites. The younger embryos (HH20) presented a less intense signal than more developed embryos (HH24), and this signal began at the most distaI region in relation to the neural tube/notochord complex. Analyses of the transversal histological sections of the hybridizated embryos showed that myostatin expression occurs in the myotomal region of the somite
 
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Publishing Date
2019-11-08
 
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