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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.11.2008.tde-13102008-141510
Document
Auteur
Nom complet
Eveline Carla da Rocha Tavano
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2008
Directeur
Jury
Mendes, Beatriz Madalena Januzzi (Président)
Harakava, Ricardo
Mourão Filho, Francisco de Assis Alves
Titre en portugais
Organogênese in vitro e transformação genética de limão 'Volkameriano' (Citrus volkameriana) e laranja azeda (Citrus aurantium)
Mots-clés en portugais
Cultura de tecidos vegetais
Genética vegetal
Laranja
Limão
Morfogênese fegetal
Organogenese vegetal - técnica in vitro
Plantas transgênicas.
Resumé en portugais
A transformação genética possibilita a introdução de genes de interesse agronômico no genoma das plantas e pode ser empregada na tentativa de obter plantas resistentes a doenças. No entanto, para se obter uma planta transgênica é necessário primeiramente estabelecer um procotolo eficiente de regeneração de plantas in vitro. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a organogênese in vitro e a transformação genética de limão Volkameriano e laranja azeda com um fragmento do gene da capa protéica do CTV. Para a organogênese in vitro utilizou-se, como explante, segmento internodal, obtido de planta cultivada em casa-de-vegetação, segmento de epicótilo, coletado de plântula cultivada in vitro e segmento de cotilédone associado ao hipocótilo obtido de semente introduzida in vitro. Esses explantes foram mantidos em meio de cultura EME suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L- 1), sendo incubados sob fotoperíodo de 16 h de luz ou em condições de escuro por 30 dias e então transferidos para fotoperíodo de 16 h de luz. A avaliação foi realizada após 45 dias de cultivo, determinando-se o número de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A caracterização anatômica do processo de regeneração foi realizada por meio de cortes histológicos. Pela análise dos dados foi possível verificar que a organogênese in vitro ocorreu a partir dos três tipos de explantes testados, sendo que, nas duas espécies em estudo, os melhores resultados foram obtidos com o cultivo de segmento de cotilédone associado ao hipocótilo. As concentrações de BAP que estimularam as melhores taxas de regeneração foram de 1,0 e 1,5 mg L-1, para limão Volkameriano, e 0,5 e 1,0 mg L-1 para laranja azeda. A incubação dos explantes em ausência de luz favoreceu a regeneração in vitro. Pela análise histológica foi possível observar que o processo de regeneração, a partir dos três tipos de explantes testados, ocorreu por meio de organogênese indireta. O protocolo de desenvolvimento estabelecido durante os experimentos de organogênese in vitro foi utilizado para a transformação genética dessas espécies via Agrobacterium, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201, com um fragmento do gene da capa protéida do CTV, em uma construção gênica do tipo hairpin. As gemas de limão Volkameriano e laranja azeda identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS foram enxertadas in vitro em citrange Carrizo. A confirmação da transformação genética foi realizada pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento de 671 pb, correspondente a parte do gene amplificada.
Titre en anglais
In vitro organogenesis and genetic transformation of the Volkamer lemon (Citrus volkameriana) and sour orange (Citrus aurantium)
Mots-clés en anglais
Adventitious bud
Citrus
Morphogenesis
Tissue culture
Transgenic
Resumé en anglais
Genetic transformation permits the introduction of agronomically important genes in plant genome and can be utilized in order to produce disease resistant plants. However for the recovery of transgenic plants is required to establish an efficient in vitro plant regeneration protocol. In this work the aim was to study an in vitro organogenesis and the genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with a sequence of the CTV coat protein gene. For in vitro organogenesis explant internodal segments collected from plants cultivated in greenhouse, epicotyl segments obtained from in vitro cultivated seedlings and cotyledon fragment with hypocotyl attached obtained from in vitro germinated seed were used as explant. These explants were cultured in EME medium supplemented with benzilaminopurine (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L-1). Cultures were maintained under a 16 h photoperiod or in the dark for 10 d and then transferred to a 16 h photoperiod. The evaluation was performed 45 d after the incubation determining the number of responsive explant and the number of buds per explant. The anatomical characterization of in vitro regeneration process was carried out through histological analyses. The in vitro organogenesis occurred in the three types of explant tested, however cotyledon fragment with hypocotyl attached showed higher morphogenetic potential in both species. The best responses of regeneration were obtained when the medium was supplementation with 1,0 e 1,5 mg L-1 BAP for the Volkamer lemon and 0,5 e 1,0 mg L-1 BAP for the sour orange. The incubation in darkness favored the in vitro regeneration. The histological analyses showed that the regeneration process occurred through indirect organogenesis in the three types of explants tested. The developed protocol was use for genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with Agrobacterium, containing pCAMBIA 2201 plasmid with a sequence of CTV coat protein gene, in a hairpin construction. Volkamer lemon and sour orange shoots identified as transgenic by histochemical test GUS were micrografted into Carrizo citrange. PCR analysis were performed after micrografted showing the presence of the 671 pb fragment of the transgene.
 
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Eveline_Tavano.pdf (1.10 Mbytes)
Date de Publication
2008-10-20
 
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  • SORIANO, L., et al. In vitro organogenesis of Rangpur Lime. Revista Brasileira de Fruticultura , 2012, vol. 34, p. 349-355.
  • TAVANO, E.C.R., et al. In vitro organogenesis of Citrus volkameriana and Citrus aurantium. Biologia Plantarum, 2009, vol. 53, n. 2, p. 395-399.
  • TAVANO, Eveline Carla da Rocha, et al. In vitro organogenesis of Citrus volkameriana and Citrus aurantium [doi:10.1007/s10535-009-0075-2]. Biologia Plantarum [online], 2009, vol. 53, p. 395-399.
  • TAVANO, Eveline Carla da Rocha, et al. Organogênese in vitro e transformação genética de limão 'Volkameriano'(citrus volkameriana) e laranja 'azeda' (Citrus aurantium). In Congresso Brasileiro de Fisiologia Vegetal, Gramado/RS, 2007. Congresso Brasileiro de Fisiologia Vegetal - Fossíntese: a essência da vida. : Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, 2007. Resumo.
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