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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.11.2019.tde-20191218-131852
Documento
Autor
Nome completo
Irving Joseph Berger
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2000
Orientador
Título em português
Sequenciamento e análise de fragmentos cloroplastidiais de tomate para construção de vetores de transformação de cloroplastos via recombinação homóloga
Palavras-chave em português
(TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
CLOROPLASTOS VEGETAIS
GENOMAS
RECOMBINAÇÃO GENÉTICA
SEQUÊNCIA DO DNA
TOMATE
Resumo em português
A coordenação de células vegetais requer a participação de três sistemas genéticos distintos, porém interdependentes durante seu desenvolvimento. Além da informação genética alojada no núcleo, células vegetais contém DNA em seus cloroplastos e mitocôndrias, as quais são organelas semi-autônomas possuidoras de sua própria maquinaria necessária à transcrição gênica, síntese proteica e parte da replicação. O estudo de novas alternativas tecnológicas levou ao desenvolvimento da tecnologia de transformação do genoma cloroplastidial (plastoma) de plantas superiores, gerando otimistas expectativas no melhoramento de plantas. Plantas possuindo genoma cloroplastidial transformado (transplastômicas) possuem algumas vantagens quando comparadas aos transformantes nucleares, pois possibilitam transformação dirigida, garantem segurança ambiental na dispersão de genes via pólen, uma vez que a característica de herdabilidade maternal dos cloroplastos ocorre na maioria das espécies ultivadas, e apresentam extraordinários níveis de expressão do gene introduzido. O sistema de transformação de cloroplastos de plantas superiores foi desenvolvido inicialmente em tabaco e mais recentemente em Arabidopsis thaliana e batata (Solanum tuberosum). As semelhanças genéticas entre tabaco e tomate (ambos pertencentes à família Solanaceae) apontam essa importante espécie como forte candidata ao sucesso na expressão de transgenes, disponibilizando ao melhorista de plantas uma ferramenta altamente eficiente e vantajosa. Visando o desenvolvimento da tecnologia de transformação de cloroplastos de tomate (Lycopersicon esculentum L.) fragmentos cloroplastidiais de tomate IAC-Santa Clara foram clonados e analisados para a construção de vetores de transformação via recombinação homóloga. Isolamento e clonagem de fragmentos PstI/SalI de cloroplastos de tomate deram origem aos plasmídios pIJB1 e pIJB2, contendo fragmentos de 8.660 pb e 6.366 pb respectivamente. Seqüenciamento e análise dos fragmentos revelaram que as seqüências são altamente homólogas aos respectivos fragmentos em tabaco, especialmente nas regiões codificadoras, e o mapeamento gênico mostrou que o posicionamento relativo das regiões codificadoras é também conservado entre as duas espécies. Espaços intergênicos mostraram-se menos conservados, sugerindo que divergências evolutivas ocorram principalmente em áreas não diretamente envolvidas na expressão gênica. Uma diferença bastante marcante encontrada está em um fragmento de 437 pb presente em tabaco entre as regiões codificadoras dos genes trnE e trnT e ausente no DNA cloroplastidial de tomate. Análise do padrão de restrição das seqüências cloroplastidiais apontou a seqüência SmaI/XhoI (2404 pb) contendo o sítio único de restrição StuI entre os genes petN e psbM como opção ideal para a construção de vetores de transformação de cloroplastos de tomate. Foi construído um cassete plastídio-específico atpI-aadA-rps14, que confere resistência aos antibióticos espectinomicina e estreptomicina, o qual foi inserido no sítio StuI na seqüência alvo SmaI/XhoI. Assim, permitiu a construção de dois vetores para transformação de cloroplastos de tomate, pIJB18 e pIJB20 disponíveis para a inserção de novos genes de interesse agronômico nesta espécie. Transformação de cloroplastos poderá facilitar o estudo da regulação gênica cloroplastidial e auxiliar o melhoramento genético de espécies cultivadas. O recente sucesso na expressão de toxinas conferindo resistência a insetos, resistência ao herbicida glifosato e especialmente de hormônio do crescimento humano em cloroplastos de tabaco, levam a acreditar que a tecnologia promete revolucionar o conceito e a aplicabilidade das plantas transgênicas no melhoramento genético.
Título em inglês
Sequencing and analyses of tomato chloroplast DNA fragments for construction of chloroplast transformation vectors via homologous recombination
Resumo em inglês
Plant cell coordination involves three different genetic systems, which are interdependents during its development. Besides the genetic information localized in the nucleus, plant cells contain DNA in chloroplasts and mitochondria, which are semi- autonomous organelles with its own necessary machinery for transcription, protein synthesis and part of replication. Studies for new alternative technologies made possible the development of the chloroplast genome (plastome) transformation technology, generating optimistic expectations in plant biotechnology. Chloroplast genome transformed plants (transplastomic plants) have some advantages when compared to nuclear transformants, they facilitate driven transformation, they guarantee environmental safety concerning gene dispersion and they present extraordinary expression levels of the introduced gene. Chloroplast transformation technology for higher plants was first developed in tobacco and more recently in Arabidopsis thaliana and potato (Solanum tuberosum). The genetic similarity between tobacco and tomato chloroplast genomes (both belonging to the Solanaceae family) point these important species as strong candidate to the success in transgene expression, making available a highly efficient and advantageous tool to plant breeders. Seeking the development of the tomato (Lycopersicon esculentum L.) chloroplast transformation  technology, chloroplast DNA fragments of IAC- Santa Clara tomato were cloned and analyzed for transformation vectors construction. Isolation and cloning of Pstl/SalI tomato chloroplast fragments generated the pIJB1 and the plJB2 plasmids, with fragments of 8,660 bp and 6,366 bp respectively. Sequencing and analysis of both fragments revealed that the sequences are highly homologous to the respective fragments in tobacco, specially  concerning coding regions. Gene mapping showed that the relative positioning of the coding regions is also conserved between the two species. Intergenic spaces was shown less conserved, indicating that evolutionary divergences occurs mainly in regions that are probably not directly involved in gene expression. The biggest difference found is a 437 pb fragment present in tobacco between the coding regions of the trnE and trnT genes but absent in the tomato chloroplast DNA. Restriction pattern analysis of the chloroplast sequences pointed the Smal/XhoI (2404 pb) sequence with a single Stul restriction site between the petN and psbM genes as ideal option for vector construction and consequent tomato chloroplast transformation. Plastid-specific cassette atpI-aadA-rps14, confering resistance against spectinomycin and streptomycin, was constructed and inserted into the Smal/ Xhol targetting sequence at the Stul site, allowing the construction of two vectors for tomato chloroplast transformation, pIJB18 and plJB20. Both are available for insertion of new genes and their expression in this species. It is clear that the ability to transform chloroplasts will facilitate the study of plastid gene regulation and the application of the genetic engineering in the improvement of crop species. Recent successes on expression of exogenous genes: toxins confering resistance to insects, resistance to glyphosate and especially human growth hormone synthesis in tobacco chloroplasts, suggest that the technology promises to revolutionize the concept and the application of the transgenic plants in the genetic breeding.
 
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Data de Publicação
2019-12-19
 
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