Miosina-V é uma miosina ligante de calmodulina não convencional enriquecida em cérebro que está provavelmente envolvida no transporte de vesículas em neurônios e células gliais. Análise bioquímica e estrutural mostrou que esta miosina é composta por 3 grandes domínios: um domínio cabeça-motor, uma região pescoço e uma cauda com regiões em "coiled-coil" e globulares. O domínio pescoço, entre os resíduos 765 e 909, contém uma série de seis repetições imperfeitas de aproximadamente 23 aminoácidos que são ricas em resíduos hidrofóbicos e básicos e apresentam a sequência concenso IQXXXRGXXXRXXY, denominada "motivo IQ". Estas repetições são similares ao sítio ligante de calmodulina da neuromodulina e as repetições presentes na junção cabeça-cauda da miosina-I de borda em escova. Ambas as proteínas e miosina-V ligam calmodulina de maneira independente de Ca2+. O "motivo-IQ" também está presente em todas as outras miosinas conhecidas, na região correspondente aos sítios ligantes de cadeias leves. Recentemente, as estruturas tridimensionais da região ligante de cadeias leves da miosina-II de músculo esquelético de galinha e de molusco de concha foram resolvidas, demonstrando que o "motivo-IQ" é o sítio de ligação das cadeias leves essencial e regulatória. O presente trabalho resultou na expressão em E. coli do domínio pescoço em fusão com a proteína ligante de maltose e sua purificação através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina de CaM acoplada à sepharose 4B. Observou-se ligação da proteína de fusão à calmodulina na ausência e presença de Ca2+. Entretanto, uma ligação mais forte ocorreu na presença de Ca2+ e alta força iônica. A ligação com ou sem Ca2+ foi confirmada usando os ensaios de "overlay" com CaM-biotinilada como uma sonda e estreptavidina conjugada a fosfatase alcalina como sistema de detecção. Também o complexo formado entre o pescoço expresso e a calmodulina biotinilada em solução foi capturada por esferas magnéticas ligadas a estreptavidina na presença e ausência de Ca2+. Foi possível clivar a proteína de fusão, utilizando o fator Xa de coagulação bovino, liberando o domínio pescoço livre da PLM.

Myosin-V is a member of a novel structural class of unconventional myosins. This protein was first identified as a calmodulin-binding protein abundantly expressed in brain tissue and seems to play a role in the vectorial transport of vesicles in neurons and glial cells. Biochemical and structural analysis has shown that myosin-V has three principal domains: a motor domain (head), a neck domain and a tail domain with coiled-coil and globular regions. The neck domain (aa 765-909) contains six copies of the consensus sequence known as the IQ-motif which has the pattern IQxxxRGxxxRxxY. These repeats are similar to the calmodulin binding site of neuromodulin, and to the repeats present in the head-tail junction of brush border myosin-I. Both of these proteins and myosin-V have been shown to bind cahnodulin in a Ca2+-independent manner. This sequence is also present in all other myosins, in the region corresponding to the light chain binding sites. Recently, studies on the structure of the regulatory domains of chicken skeletal and scallop myosins-II demonstrated that the IQ motif is part of the binding site for the essential and regulatory light chains. This work presents the expression in E. coli of the neck domain in fusion with maltose binding protein and purification by affinity chromatograpfy, allowing for the obtention of sufficient amounts of protein to characterize its binding to calmodulin. Using a resin of calmodulin conjugated to Sepharose 4B, we observed binding of the fusion protein to calmodulin in the absence or presence of Ca2+. However a stronger binding ocurred in the presence of Ca2+ and high ionic strength. This interaction with or without Ca2+ was confirmed by overlay assays using biotinylated CaM as a probe and streptavidin conjugated to alkaline-phosphatase as a detection system. Also, the complex formed between the expressed neck and biotinylated CaM in solution was captured by streptavidin coated magnetic beads in the presence and absence of Ca2+. It was possible to cleave the fusion protein, using the bovine plasma factor Xa, liberating the neck domain.