Foi demonstrado anteriormente nos modelos de endotoxemia e de ligadura e perfuração de ceco (CLP) que a redução da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal está correlacionada com o pior prognóstico da doença. Assim, objetivamos no presente estudo: a - Padronizar o modelo de sepse induzido por S. aureus; b - Caracterizar o fenômeno da redução da migração de neutrófilos para o foco infeccioso; e - correlacionar o maior ou menor recrutamento dos neutrófilos na cavidade peritoneal, com o número de bactérias nesta cavidade e no sangue; d - investigar a participação de citocinas como TNF-α e IFN-γ na redução da migração de neutrófilos; e - analisar o possível papel do NO na redução da migração de neutrófilos; f - identificar o tipo de célula residente, como fonte de mediadores envolvidos na redução da migração de neutrófilos. Dois grupos experimentais foram estabelecidos: o grupo subletal (SL) (0,5x10^9 UFC/cavidade) apresentou 100% de sobrevida, migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal (12x10^6 neutrófilos/cavidade) e pequena quantidade de bactérias no exsudado peritoneal e ausência de bacteremia. Por outro lado, o grupo que recebeu inóculo letal (L) (16x10^9 UFC/cavidade) apresentou 100% de mortalidade, além de redução da migração dos neutrófilos para cavidade peritoneal (4x10^6 neutrófilos/cavidade), grande presença de bactérias na exsudato peritoneal e acentuada bacteremia. Ainda neste grupo, foi observado edema agudo de pulmão e infiltrado de PMN neste órgão. Ambos os grupos experimentais apresentaram níveis elevados de TNF-α, IL-1β e IL-10, tanto no soro, quanto no exsudato, caracterizando dessa forma o modelo de sepse utilizado no presente estudo. Objetivando estudar a participação de TNF-α e IFN-γ no fenômeno da falência da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal, foram utilizados animais deficientes para o receptor p55 de TNF-α e animais deficiente para a produção de IFN-γ. Ambos os grupos, selvagens e deficientes, que receberam inóculo letal apresentaram resultados semelhantes quanto à falência da migração, sobrevida e quantidade de bactérias no exsudato peritoneal. Entretanto, os animais deficientes que receberam inóculo subletal apresentaram maior número de bactérias na cavidade e maior letalidade do que os selvagens, apesar do número de neutrófilos no foco infeccioso ser semelhante. Desta maneira, sugerimos que a redução da migração dos neutrófilos para a cavidade peritoneal não é mediada pelo TNF-α ou IFN-γ, embora sugerimos a participação destas citocinas na atividade bactericida dos neutrófilos. O envolvimento do óxido nítrico (NO) no presente modelo foi estudado a partir da administração de aminoguanidina. O pré-tratamento com esta droga seguido da administração da inóculo letal preveniu a redução da migração de neutrófilos, reduziu a quantidade de bactérias no exsudato peritoneal e sangue, embora a taxa de sobrevida foi a mesma nos animais pré-tratados ou apenas inoculados. A administração de uma dose de 5 mg/kg de aminoguanidina, 6 horas após a inoculação letal, apresentou sobrevida de 40%, acompanhada da prevenção da migração dos neutrófilos e diminuição do número de bactérias no exsudato peritoneal. O conjunto destes dados demonstram que o NO participa da redução da migração dos neutrófilos para a cavidade peritoneal e que esta redução está correlacionada com o pior prognóstico da doença. Corroborando com os dados de que o NO está envolvido na falência da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal, estudo da migração in vitro de neutrófilos revelaram que neutrófilos provenientes de animais que receberam inóculo letal possuíam menor capacidade quimiotáxica. Além disto, o pré-tratamento com aminoguanidina restabeleceu esta capacidade. Caracterizando a importante atividade microbicida do NO no presente modelo, o grupo subletal tratado com aminoguanidina (30 minutos antes da inoculação e 2 horas após), apresentou maior quantidade de bactérias presentes no exsudato peritoneal e bacteremia, apesar de manter o número de neutrófilos na cavidade semelhante aos animais não tratados. Além disto, a sobrevida dos animais tratados é 50% menor. Dados que corroboram com os anteriormente citados, foram obtidos de animais deficientes para a enzima NOSi. Os animais deficientes que receberam inóculo subletal apresentaram maior quantidade de bactéria na cavidade peritoneal, assim como uma menor taxa de sobrevida do que os animais selvagens que receberam a mesma inoculação. Estes dados analisados em conjunto demonstram a importância do NO como agente bactericida do S. aureus. No que se refere à participação de outros tipos celulares como fonte de mediadores envolvidos na redução da migração de neutrófilos para o sítio infeccioso, observamos que tanto o aumento do número de macrófagos, quanto a diminuição dos mastócitos residentes na cavidade peritoneal, preveniram a redução da migração de neutrófilos, diminuíram a quantidade de bactérias presentes no exsudato peritoneal e sangue. Nestes animais a taxa de sobrevida foi de 100%. Assim o aumento do número de macrófagos residentes melhora o prognóstico da doença, entretanto os mastócitos parecem ser a fonte de mediadores envolvidos na redução da migração de neutrófilos no presente modelo de sepse.

Septic shock is one of the leading causes of mortality among severely ill patients in intensive care units all over the world, with mortality rates ranging from 35% to 45% of patients. Today the incidence of Gram-positive bacteria is similar to that of Gram-negative bacteria in terms of the pathogenesis of sepsis (Sriskandan & Cohen, 1999), thus pointing out the importance of better understanding the mechanisms involved in Gram-positive septicemia. The objective of the present study were: a - to establish a Staplhylococcus aureus model of Gram-positive sepsis in mice; b - to define the failure of neutrophil migration towards the infectious focus in the present model; c - to analyze the role of TNF-α, IFN-γ and NO in the failure of neutrophil migration; d - to define the role of the other resident cells in the process, such as resident macrophages and mast cells. We first observed that a sublethal (SL-group) challenge with Staplhylococcus aureus (0.5x10^9 UFC/cavity) caused a neutrophil migration of 9x10^6 cells per abdominal cavity. The mice did not present bacteremia. On the other hand, lethal challenge (L-group) (16x10^9 UFC/cavity) caused severely bacteremia and death within 24 h with failure of neutrophil migration to the focus (4x10^6 cells/cavity). Twelve hours after the lethal challenge, histopathological analysis of multiple organ failure revealed diffuse lung edema and an intense PMN infiltrate in both organs. The failure of neutrophil migration was not due to neutropenia or hemodynamic alterations, since the leukogram of the L-group showed neutrophilia 4 hours before bacterial inoculation and arterial blood pressure monitoring did not show a significant difference compared to the SL-group. The same pattern of response to lethal bacterial inoculation was observed in knockout mice lacking p55R for deficient TNF-α or IFN-γ production, thus suggesting an irrelevant role of both TNF-α and IFN-γ in the failure of neutrophil migration to the abdominal cavity. On the other hand, SL-deficient mice presented a decreasing survival rate and an increased bacterial number in peritoneal fluid, suggesting the importance of both cytokines in bactericidal activity. The failure of neutrophil migration was prevented in aminoguanidine- or D-penicillamine-pre-treated animals. This was accompanied by a decrease in bacterial number in the peritoneal fluids and in bacteremia. On the other hand, aminoguanidine did not prevent animal death. The addition of a lower aminoguanidine dose (5 mg/kg) 6 hours after lethal inoculation was able to induce a decrease in bacterial number in the peritoneal fluid and in bacteremia. This result indicates the relevant role of NO in the failure of neutrophil migration. To investigate the role of NO in bactericidal activity against S. aureus, we administered two doses of aminoguandine to the SL-group, which caused increased bacterial numbers in peritoneal fluid and bacteremia, accompanied by a decrease in survival rate. ln addition, NOSi-deficient animals inoculated with SL also presented an increase in bacterial number in peritoneal fluid and a decrease in survival rate. Taken together, the present results lead us tot speculate that the low survival rate was a consequence of an impairment of the bactericidal activity of neutrophils due to the lack of NO. ln vitro neutrophil migration experiments using a microchamber demonstrated that neutrophil from mice challenged with the lethal bacterial dose presented an impaired migration compared to cells from sublethally inoculated animals. Moreover, the results for control animals (no bacterial challenge) were similar results to those for the SL-group. Similarly to the in vivo data, aminoguanidine-pre-treated animals recovered their migration chemotactic activity. The increase in resident peritoneal macrophages and the decrease in mast cells prevented neutrophil migration failure, decreased bacterial number in peritoneal fluid and bacteremia and prevented death in 100% of animals. These results demonstrate the importance of mast cells as sources of mediator(s) involved in the failure of neutrophil migration, and that macrophages are important for protecting the animals against infection. ln conclusion, it was demonstrated that NO plays an important role in the failure of neutrophil migration to the infectious focus and is important in the killing of S. aureus in the present experimental model of sepsis.