O envolvimento de citocinas, particularmente TNF-α, na hiperalgesia foi demonstrado por nosso laboratório através do modelo de Randall-Selitto modificado, sugerindo que a BK exerce seu efeito hiperalgésico através da liberação desta citocina (Ferreira, 1993). O objetivo do presente trabalho é demonstrar que a BK induz a produção de TNF membranar e solúvel por macrófagos peritoneais de camundongos. Para isto macrófagos foram coletados do peritôneo de camundongos pré-tratados com adjuvante completo de Freund e estimulados in vitro com BK. As membranas, bem como sobrenadante destas células foram submetidos ao ensaio de citotoxicidade sobre células WEHI 164 para determinação da presença de TNF nas amostras. Demonstrou-se que membranas e sobrenadante de macrófagos peritoneais obtidos de camundongos pré-tratados com adjuvante completo de Freund exercem atividade citotóxica em células WEHI 164. Um anticorpo anti-TNF-α bloqueou a atividade das membranas e do sobrenadante de macrófagos incubados com BK em 80 e 60% respectivamente, demonstrando que esta atividade citotóxica se deve predominantemente ao TNF em suas formas membranar e solúvel. Curiosamente, macrófagos provenientes de animais normais incubados com BK não produziram TNF membranar ou solúvel. Por outro lado, o LPS mais IFNγ induziram a produção de TNF de ambos os tipos por macrófagos provenientes de animais normais e daqueles tratados com adjuvante completo de Freund. Este fato sugere que a BK necessita de um segundo sinal, que neste estudo e o adjuvante completo de Freund, que irá facilitar o efeito da BK na indução da produção de TNF membranar e solúvel por macrófagos. Para elucidação do receptor de BK envolvido na produção de TNF membranar e solúvel, agonista e antagonista B1 e B2 de BK foram utilizados. A expressão do TNF membranar induzida pela BK foi bloqueada pelo antagonista B2, HOE 140, enquanto que este antagonista não impediu a produção de TNF solúvel. Assim o receptor B2 da BK pode estar envolvido na expressão de TNF membranar em macrófagos estimulados com BK, mas não medeia a produção de TNF solúvel quando estudados neste modelo. Diante destes resultados sugerimos que o receptor B2 pode estar mediando a resposta local induzida pela BK. Quando analisamos o envolvimento do receptor B1 na produção de TNF membranar e solúvel, observamos que antagonista B1, des-Arg9-[Leu8]-bradicinina, não bloqueou a produção de TNF membranar e solúvel, assim como o agonista B1, des-Arg9-BK não induziu a produção de ambos os tipo de TNF, sugerindo que o receptor B1 não participa neste fenômeno. Finalmente o presente trabalho não demonstrou qual o receptor envolvido na liberação de TNF solúvel por macrófagos incubados com BL, a este resultado podemos inferir a participação de um outro tipo de receptor da BK, como por exemplo B2-A ou B2-b, ou ainda B3, B4 ou B5. O conjunto dos resultados apresentados confirmam a proposição feita anteriormente por Ferreira et al. (1993) de que BK evoca hiperalgesia, indiretamente, através da produção de TNF solúvel e membranar.

The envolvement of cytokines, mainly TNF-α, in the hiperalgesia was suggesting by our laboratory, using modified Randall-Sellito method, that BK exerts its hiperalgesic effect through release of this citokyne (Ferreira, 1993). The aim of the present study is to investigate if BK induce the production of membrane-associated and soluble TNF-α by peritoneal murine macrophages. The method used was the harvesting of peritoneal murine macrophages from animals pre-treated with complete Freund's adjuvant (CFA) and then stimulation of these cells in vitro with BK. The membranes, as well the supernatants from macrophages were submitted to citotoxic WEHI 164 essay to determine the presence of TNF-α in the samples. It was demonstrated that membranes and supernatant from peritoneal macrophages obtained from animal pre-treated with Complete Freunds Adjuvant (CFA) have citotoxic activity under WEHI 164 cells. Antibody against TNF-α blocked 80 and 60% of the citotoxic activity of membrane and supernatant, respectively, demonstrating that the citotoxic activity is due to the membrane-associated and soluble TNF-α. Curiously, macrophages from normal animal incubated with BK did not produced associated and membrane forms of TNF-α. However, LPS plus IFNγ induced the production of both type of TNF from macrophages otained from normal animals and from animals pre-treated with CFA. It suggested us that BK needs a second signal, in this case is CFA, to improve the production of membrane and soluble TNF from macrophages incubated with BK. To study wich receptor is envolved in the production of membrane and soluble TNF, B1 and B2 agonist and antagonist for BK receptor were used. The expression of membrane-associated TNF by macrophages incubated with BK was blocked by B2 antagonist, HOE 140, however the production of soluble TNF was not interfered by this antagonist. So, the B2 receptor could be involved in the expression of membrane TNF but it does not interfere in the production of soluble TNF by BK incubated macrophages. We suggested that the B2 receptor could mediate local response induced by BK. When the B1 receptor was analized, it was observed that the B1 antagonist, des-Arg9-[Leu8]-BK, blocked neither membrane associated TNF nor soluble TNF. Also the B1 agonist did not induced the production of both types of TNF, suggesting that the B1 receptor is not involved in this fenomen. Finally, the present study did not demonstrated wich receptor is involved in the production of soluble TNF by macrophages incubated with BK. It was attributed to another type of BK receptor, for exemple: B2-A, B2-b, B3, B4 or B5. As a context, these results confirm the previous suggestion of Ferreira et al. (1993), that BK induce hiperalgesia, indirectly, through production of membrane-associated and soluble TNF.