A doença de Gaucher (DG), causada por mutações no gene GBA1, é a primeira doença de depósito lisossomal descrita e tornou-se o modelo para a descrição clínica e fenotípica para as doenças desse grupo. A terapia de reposição enzimática é o principal tratamento disponível para pacientes com DG, porém de alto custo. Assim, visando obter uma linhagem celular humana com expressão estável e elevados níveis da enzima lisossomal recombinante GBA humana, a hipótese desse estudo é que a agregação do uso de códons sinônimos, engenharia genética e sistema lentiviral permitirá a geração de uma nova molécula recombinante biologicamente ativa in vitro. Para alcançar esse objetivo, primeiramente foi realizada a transfecção transiente a fim de avaliar se os vetores lentivirais eram funcionais, o que foi demonstrado pelo aumento da atividade de GBA no sobrenadante das linhagens por meio do ensaio de atividade biológica da GCase. A partir desses resultados foram produzidas partículas lentivirais referentes às sequências de cDNA da GBA com os códons originais e sinônimos, ambas construções sob o controle do promotor HeF1α. Os títulos lentivirais foram cerca de 5,24x108 e 7,88x108 PV/mL, referente aos plasmídeos LV_HeF1α_GBA_WT e LV_HeF1α_GBA_SYN, respectivamente. Foram realizados seis ciclos de transdução com MOI entre 30-60, e após as transduções, as linhagens foram tratadas com puromicina. Seguido de clonagem celular das populações mistas foram selecionados os clones com níveis mais elevados da enzima recombinante. As análises de atividade biológica no sobrenadante da linhagem L18_293FT_GBA_WT_PM foi de 2,72 U/mL, enquanto que para L17_293FT_GBA_SYN_PM foi de 104,8 U/mL. Com relação aos clones que apresentaram níveis mais elevados de atividade da GBA obtivemos o clone 4 (19,73 U/mL) e o clone 9 (17,08 U/mL) para a L18, e os clones 15 (585,46 U/mL) e 16 (683,95 U/mL) para a L17. As análises de atividade intracelular da GBA para ambas as linhagens e seus respectivos clones mostraram níveis enzimáticos da ordem de 108,4 U/mg para a população mista da L18, 146,5 U/mg para o clone 4 e 159,8 U/mg para o clone 9. A atividade intracelular para a população mista da L17 foi de 307,5 U/mg e para os clones 15 e 16 foram cerca de 586,3 e 752,3 U/mg. O ensaio de espectrometria de massa mostrou a quantificação da enzima lisossomal recombinante no sobrenadante e intracelular produzida pela linhagem celular L18_293FT_GBA_WT_PM e os resultados mostraram níveis similares a GBA produzida pela linhagem celular virgem. Por outro lado, a linhagem L17_293FT_GBA_SYN_PM apresentou elevados níveis da enzima lisossomal recombinante GBA no sobrenadante da ordem de 38,39 µg de GBA e os clones 15 e 16 cerca de 60,15 e 53,23 µg de GBA, respectivamente. A quantificação da enzima GBA recombinante intracelular foi cerca de 14,08 µg para a população mista e para os clones 15 e 16 foi de 6,17 e 5,34 µg de GBA, respectivamente. Foi realizado também o escalonamento da população mista L17 e os resultados mostraram ser possível a expansão da produção da GBA em larga escala. Desta forma, concluímos que o sistema lentiviral foi efetivo e esse conjunto de informações levam a interpretação de que o uso de códons sinônimos pode consistir em uma estratégia promissora para obtenção de uma linhagem celular humana com elevados níveis da enzima lisossomal recombinante.

Gaucher disease (DG), caused by mutations in the GBA1 gene, is the first lysosomal storage disease described and has become the model for the clinical and phenotypic description of the diseases in that group. Enzyme replacement therapy is the main treatment available for patients with DG, but high cost. Thus, in order to obtain a human cell line with stable expression and high levels of recombinant human GBA lysosomal enzyme, the hypothesis of this study is that the aggregation of the use of synonymous codons, genetic engineering and lentiviral system will allow the generation of a new biologically active recombinant molecule in vitro. To achieve this goal, transient transfection was first performed to assess whether the lentiviral vectors were functional, which was demonstrated by the increase of GBA activity in the supernatant of the lineages by the biological activity assay of GCase. From these results lentiviral particles were produced relative to the GBA cDNA sequences with the original and synonymous codons, both constructs under the control of the HeF1α promoter. The lentiviral titers were about 5.24x108 and 7.88x108 PV / mL, referring to plasmids LV_HeF1α_GBA_WT and LV_HeF1α_GBA_SYN, respectively. Six cycles of MOI transduction were performed between 30-60, and after transduction, the lines were treated with puromycin. Following cloning of the mixed populations, clones with higher levels of the recombinant enzyme were selected. Analyzes of biological activity in the supernatant of the L18_293FT_GBA_WT_PM line was 2.72 U / ml, whereas for L17_293FT_GBA_SYN_PM it was 104.8 U / ml. In relation to the clones that presented higher levels of GBA activity, we obtained clone 4 (19.73 U / mL) and clone 9 (17.08 U / mL) for L18, and clones 15 (585.46 U / mL) and 16 (683.95 U / mL) for L17. Intracellular activity analyzes of GBA for both strains and their respective clones showed enzyme levels in the order of 108.4 U / mg for the mixed population of L18, 146.5 U / mg for clone 4 and 159.8 U / mg for clone 9. Intracellular activity for the mixed population of L17 was 307.5 U / mg and for clones 15 and 16 were about 586.3 and 752.3 U / mg. The mass spectrometry assay showed quantification of the recombinant lysosomal enzyme in the supernatant and intracellular produced by the cell line L18_293FT_GBA_WT_PM and the results showed levels similar to GBA produced by the virgin cell line. On the other hand, the lineage L17_293FT_GBA_SYN_PM showed high levels of GBA recombinant lysosomal enzyme in the supernatant on the order of 38.39 µg GBA and clones 15 and 16 about 60.15 and 53.23 µg GBA, respectively. The quantification of recombinant intracellular GBA enzyme was about 14.08 µg for the mixed population and for clones 15 and 16, it was 6.17 and 5.34 µg GBA, respectively. It was also carried out the scheduling of the mixed population L17 and the results showed that it is possible to expand the production of GBA on a large scale. In this way, we conclude that the lentiviral system was effective and this set of information leads to the interpretation that the use of synonymous codons may consist of a promising strategy to obtain a human cell line with high levels of the recombinant lysosomal enzyme.