A doença de Gaucher (DG) é uma doença de acúmulo lisossomal, com padrão de herança autossômico recessivo, devido a mutação no gene que codifica a enzima β-glicosilceramidase ácida (GBA), que hidrolisa o esfingolipídeo glicosilceramida. Atualmente, o tratamento mais utilizado para a DG é a Terapia de Reposição Enzimática (TRE), que faz uso de infusões de GBA recombinante para elevar o catabolismo da glicosilceramida. Entre as diferentes estratégias para produção de GBA recombinante o uso do sistema lentiviral é pouco explorado. Nesse sentido, esse trabalho visa a geração de uma linhagem celular humana com produção estável da enzima β-glicosilceramidase recombinante utilizando o sistema lentiviral. Como controle, foram geradas linhagens celulares humanas com expressão estável da proteina recombinante GFP (green fluorescent protein) para avaliar a eficiência da transdução por meio de diferentes quantidades virais. Primeiramente foram produzidas partículas lentivirais por meio da transfecção dos respectivos plasmídeos na linhagem celular 293-FT. A análise do título viral das partículas lentivirais portadoras dos cDNAs codificantes para GFP e GBA revelou níveis da ordem de 7,9 x 10⁶ e 4,3 x 10⁷ unidades transducionais/ mL de sobrenadante, respectivamente. Em seguida foram geradas duas linhagens celulares humanas com produção estável de GFP: 1) L22_293-FT_GFP_M1 transduzida com MOI igual a 1,0 e um ciclo de transdução e que mostrou apresentar 67% de células positivas para GFP e 2) L22_293-FT_GFP_M10 transduzida com MOI igual a 10 e três ciclos de transdução e que mostrou apresentar 94% de células positivas para GFP. Esses dados sugerem que houve diferença no nível de expressão conforme o MOI utilizado e o número de ciclos de transdução. Com base nessas informações, foi gerada uma terceira linhagem celular humana nomeada L20_293-FT_GBA_Mut-1 com MOI igual a 15 e produção estável da enzima GBA recombinante. Após a seleção da linhagem celular L20_293-FT_GBA_Mut-1 com puromicina, a molécula GBA_Mut-1 foi caracterizada pelo ensaio de fluorimetria para avaliação da atividade biológica da enzima recombinante. O nível da atividade biológica da enzima GBA_Mut-1 presente no sobrenadante foi 34,19 + 4,74 U GBA/mL e a atividade específica foi 231,8 + 51,62 U GBA/mg de proteína. Por fim, foi avaliada a produtividade da linhagem celular L20_293-FT_GBA_Mut-1 que mostrou níveis de secreção de 38,74 + 4,8 U/ 106 células e de produção intracelular de 119,1 + 34,71 U GBA/ 106 células. Em conclusão, esse trabalho mostrou a eficácia do sistema lentiviral em manter a expressão estável e duradoura da enzima lisossomal recombinante e sugere a tecnologia para geração de linhagens celulares humanas transgênicas produtoras de enzima lisossomal no sobrenadante e intracelular.

Gaucher disease (DG) is a lysosomal storage disease with an autosomal recessive inheritance pattern caused by mutation in the gene that encodes an acidic β- glucosylceramidase (GBA) enzyme, which hydrolyzes the glucosylceramide sphingolipid. Currently, the most commonly used treatment for GD is the Enzyme Replacement Therapy (TRE), which uses infusions of recombinant GBA to raise the catabolism of glucosylceramide. Among the various strategies for GBA production, the use of the lentiviral system is little explored. In this sense, this work aims to generate a human cell line with stable production of the recombinant β-glucosylceramidase enzyme using the lentiviral system. As a control, human cell lines with stable expression of the recombinant green fluorescent protein (GFP) were generated to evaluate the efficiency of the transduction by means of different viral amounts. First lentiviral particles were produced by transfection of the respective plasmids into the 293-FT cell line. Analysis of the viral titer from GFP- and GBA-expressing vectors revealed a level of 7.9x106 and 4.3x107 transductional units / mL of supernatant, respectively. Two human cell lines were then generated with stable GFP production: 1) L22_293-FT_GFP_M1 cell line transduced with MOI equal to 1 and one transduction cycle, which showed 67% GFP positive cells and 2) L22_293-FT_GFP_M10 cell line transduced with MOI equal to 10 and three transduction cycles, which showed 94% of GFP positive cells. These data suggest that there was a difference in expression level according to the MOI used and the number of transduction cycles. Based on this information, a third human cell line named L20_293-FT_GBA_Mut-1 with MOI equal to 15 and stable production of the recombinant GBA enzyme was generated. After selection of the L20_293-FT_GBA_Mut-1 cell line with puromycin, the GBA_Mut-1 molecule was characterized by the fluorimetry assay for evaluation of the biological activity of the recombinant enzyme. Biological activity levels of the GBA_Mut-1 enzyme present in the supernatant were 34.19 + 4.74 U GBA / ml and the specific activity was 231.8 + 51.62 U GBA / mg protein. Finally, the productivity of the cell line L20_293-FT_GBA_Mut-1 was determined, which showed secretion levels of 38.74 + 4.8 U/10⁶ cells and intracellular production of 119.1 + 34.71 U GBA/10⁶ cells. In conclusion, this work showed the effectiveness of the lentiviral system in maintaining the stable and long term expression of the recombinant enzyme and suggests the technology for the generation of transgenic human cell lines producing lysosomal enzyme in the supernatant and intracellular.