O câncer de mama triplo negativo (TNBC), em especial o subtipo Mesenchymal Stem-like (MSL), é considerado um dos mais agressivo dentre os subtipos categorizados molecularmente, uma vez que apresenta limitações ao tratamento, altas taxas de recorrência e baixo grau de sobrevida dos pacientes. O potencial de migração destas células e invasão a outros sítios pode variar, contudo, conforme a expressão diferencial de marcadores mesenquimais e epiteliais, sendo ambos associados ao processo de Transição Epitélio-Mesenquimal (EMT) com perda de adesão celular. Vistos como alternativa promissora às terapias atualmente disponíveis, os microRNAs (miRNAs/miRs) agem pós-transcricionalmente sobre a expressão de RNAs mensageiros alvos, muitos dos quais fundamentais à EMT, sendo importantes reguladores da progressão e metástases tumorais. Em vista do exposto, análises in silico foram usadas para identificação de miRNAs down regulados entre subtipos mais agressivos cujos genes preditos na assinatura de EMT estivessem hiper expressos em dados de amostras obtidas junto ao TCGA (The Cancer Genome Atlas). A identificação de miRNAs com potencial de regulação sobre estágios de migração e invasão celular em diferentes linhagens e amostras PDX proporcionou a realização de ensaios funcionais, como wound healing e boyden chamber assays, além de formação de esferoides e invasão à matriz, com miméticos e inibidores destes miRs, e consequentes avaliações de modulação fenotípica e morfométrica, por intermédio de imunofluorescência (IF) e High Content Analysis (HCA). Adicionalmente, genes diferencialmente expressos foram quantificados por qPCR, assim como níveis de microRNAs para diferentes subtipos celulares. Como consequência das transfecções com mimético ou inibidores dos miRNAs, enquanto com mimético do miR-30b houve aumento de EMT, foram observadas reduções significativas de atividade migratória e progressão tumoral de MDA-MB-231 quando acrescidas de miméticos dos miR-1, miR-30a, miR-34a e miR-200c, além dos inibidores dos miR-199a e miR-214. Resultados morfométricos oriundos de IF quantitativa automatizada revelaram que células mais dissociadas e transfectadas com miméticos ou inibidores dos miRNAs estudados, apesar de reportarem aumento da intensidade de marcadores mesenquimais (Vimentin) e redução na expressão de marcadores epiteliais (E-Cadherin), apresentaram menor potencial migratório ao reprimirem, entre outros alvos, a expressão de ZEB1. De outro modo, a regulação mediada pelo miR-34a induziu células TNBC MSL à modulação do perfil fenotípico mesenquimal e morfologia estelar, a se rearranjarem em agrupamentos celulares com conformação acinar e polaridade baso-apical semelhante a células de mama normais. Como um todo, o presente estudo pode vir a contribuir com alternativas terapêuticas para o TNBC uma vez que a entrega direcionada de moléculas miméticas ou inibidores de microRNAs às células tumorais poderiam, eventualmente, inibir as metástases.

Triple-negative breast cancer (TNBC), especially the Mesenchymal Stem-like (MSL) subtype, is considered one of the most aggressive among the molecularly categorized subtypes, since it presents treatment limitations, high recurrence rates and low degree of patient survival. The potential for migration of these cells and invasion to other sites may vary, however, according to the differential expression of mesenchymal and epithelial markers, both of which are associated with the Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) process with loss of cell adhesion. Seen as a promising alternative to currently available therapies, microRNAs (miRNAs/miRs) act post-transcriptionally on the expression of target messenger RNAs, many of which are fundamental to EMT, and are important regulators of tumor progression and metastases. Given the above-mentioned, in silico analyses were used to identify down-regulated miRNAs among more aggressive subtypes whose genes predicted in the EMT signature were overexpressed in data samples from TCGA (The Cancer Genome Atlas). The identification of miRNAs with potential to regulate the stages of cell migration and invasion in different PDX samples and breast cancer lineages allowed the performance of functional assays, such as wound healing and boyden chamber assays, as well as spheroid formation and matrix invasion, with mimetics and inhibitors of these miRs, leading to consequent evaluations of phenotypic and morphometric modulation by immunofluorescence (IF) and High Content Analysis (HCA). In addition, differentially expressed genes were quantified by qPCR, as well as microRNA levels for different cell subtypes. As a consequence of the transfections with mimetics or inhibitors, while with miR-30b mimetics there was an increase in EMT, significant reductions in migratory activity and tumor progression of MDA-MB-231 were observed when added to mimetics of miR-1, miR-30a, miR-34a and miR-200c, and also in addition to miR-199a and miR-214 inhibitors. Morphometric results from automated quantitative IF revealed that cells more dissociated and transfected with mimetics or inhibitors of the miRNAs studied, despite reporting an increase in the intensity of mesenchymal markers (Vimentin) and a reduction in the expression of epithelial markers (E-Cadherin), showed lower migratory potential by repressing, among other targets, the expression of ZEB1. On the other hand, miR-34a-mediated regulation induced TNBC MSL cells to modulate mesenchymal phenotypic profile and stellar morphology to rearrange themselves into cell clusters with acinar conformation and basal-apical polarity similar to normal breast cells. The present study may contribute to therapeutic alternatives for treatment of triple negative breast cancer since the targeted delivery of mimetic molecules or microRNA inhibitors to tumor cells could eventually inhibit metastases.