A doença de Gaucher (DG) é a doença mais comum dentre as disfunções de armazenamento lisossomal, sendo decorrente de mutações no gene que codifica a enzima β-glicosilceramidase (GBA). A terapia de reposição enzimática com GBA recombinante é a principal forma de tratamento para pacientes com DG, mas ainda é um medicamento de alto custo. Resultados recentes em nosso grupo de pesquisa mostraram, por meio da produção transiente, que a molécula mutGBA está relacionada com elevada atividade biológica e, assim, foi gerada a linhagem celular humana L16_293-FT-P2-mutGBA com produção permanente dessa enzima. Neste trabalho, o objetivo foi continuar a caracterização dessa molécula por meio de ensaios ex vivo e in vivo e realizar a clonagem dessa linhagem celular. A primeira etapa foi realizar o escalonamento da produção da enzima recombinante mutGBA pela linhagem L16_293-FT-P2-mutGBA. Assim, após o cultivo em larga escala foi possível obter 9677 U GBA no sobrenadante da cultura celular, um aumento de 217 x em relação ao cultivo em pequena escala. Na segunda etapa, a molécula mutGBA foi caracterizada por meio de ensaios ex vivo e in vivo em modelo de camundongo condicional para DG e fibroblastos de pacientes. OS fibroblastos de indivíduos saudáveis e indivíduos com DG foram caracterizados quanto o nível das três enzimas GBA (GBA lisossomal, GBA2 e GBA3). Com o uso de inibidores específicos (CBE e NB-DNJ) foi possível demonstrar que fibroblasto de indivíduo saudável produz cerca de 70,9 (+ 3,1) U GBA/mg de proteína e que 30% da atividade enzimática avaliada pelo ensaio fluorimétrico com o substrato sintético 4-MU são relativas as outras enzimas GBAs não lisossomais, sendo desses 70% GBA2 e 30% GBA3. Fibroblastos de pacientes com DG produzem cerca de 6,9 (+ 1,5) U GBA/mg de proteína e a relação para o nível das 3 enzimas GBAs foi a mesma relatada para indivíduos saudáveis. Em seguida, ensaios de uptake da enzima mutGBA e da enzima recombinante comercial (VPRIV) mostraram que as mesmas não são absorvidas por fibroblasto até 6 h de incubação. Análises ex vivo da atividade da enzima GBA em macrófagos em 6 tempos após a infusão de 19 U de mutGBA mostraram que a mesma é biologicamente ativa em macrófagos com pico mais elevado da atividade biológica no tempo de 1:30 h (46,5 U GBA/mg proteína) ou 30 min. (4 U GBA/mg proteína) em macrófago derivado de camundongo controle e camundongo com DG, respectivamente. Ensaios preliminares in vivo também foram investigados. A análise da atividade biológica da enzima GBA em baço, fígado e leucócitos após 1 hora da infusão de 19 U da enzima mutGBA permitiu mostrar um aumento de 1,4x, 1,5x e 1,8x, respectivamente, o que sugere a internalização da enzima mutGBA nesses tecidos. Por fim, foi possível realizar a clonagem celular e identificação de dois clones com maior produção de GBA em relação a população mista (p<0,05). O clone 5, com maior produção de mutGBA no sobrenadante, cerca de 301,4 (+ 4,35) U GBA/mL ou 207 (+ 3,23) U GBA /106 células e o clone 13, com maior produção de mutGBA intracelular, cerca de 622 (+ 4,35) U GBA/mg de proteína ou 325,5 (+ 3,23) U GBA/106 células Em conclusão, os dados apresentados mostram que a linhagem L16_293-FT-P2-mutGBA apresenta elevados níveis de produção de β-glicosilceramidase recombinante, é capaz de ser internalizada por macrófagos e biologicamente ativa in vivo, sendo assim, uma linhagem de produção promissora para uso na TRE.

Gaucher disease (GD) is the most common disease among lysosomal storage disorders, and is caused by mutations in the β-glucosylceramidase (GBA) enzyme encoding gene. Enzyme replacement therapy is the main treatment for GD patients, but recombinant GBA is expensive. Recent results in our research group showed, through transient production, that the mutGBA molecule possess high biological activity, so the human cell line L16_293-FT-P2-mutGBA was generated with permanent production of this enzyme. In this work, the aim was to continue the characterization of this molecule using ex vivo and in vivo assays and perform single cell cloning. First, we enhanced the production of the recombinant mutGBA enzyme from L16_293-FT-P2-mutGBA cell line. After large-scale culture we obtained 9677 U GBA in the supernatant of the cell culture, which is an 217x increase in relation to the small-scale culture. The level of the three GBA enzymes (GBA lysosomal, GBA2 and GBA3) were characterized in fibroblasts from healthy individuals and GD patients. Using specific inhibitors (CBE and NB-DNJ) we were able to show that healthy fibroblast produces 70.9 (+ 3.1) U GBA / mg protein and that 30% of the enzymatic activity evaluated by the fluorimetric assay with the synthetic substrate 4-MU are other non-lysosomal GBA enzymes. Of the non-lysosomal 30%, 70% are GBA2 enzyme and 30% are GBA3 enzyme. GD patients' fibroblasts produce about 6.9 (+ 1.5) U GBA / mg protein and the ratio for the level of the 3 GBAs enzymes was the same as reported for healthy subjects. Next, we did mutGBA enzyme uptake assays with mutGBA and a commercial recombinant enzyme (VPRIV), both molecules didn't show any enhanced GBA activity up to 6 h of incubation. Then, the mutGBA molecule was characterized by ex vivo and in vivo assays in a GD mouse model. Ex vivo analyzes of GBA enzyme activity in macrophages with infusion of 19 U mutGBA showed that the enzyme is biologically active in macrophages. The biological activity highest peak was after 1:30 h (46.5 U GBA / mg protein) or 30 min. (4 U GBA / mg protein) incubation in macrophage derived from mouse control and GD mouse, respectively. Preliminary in vivo assays were also investigated. The GBA biological activity in spleen, liver and leukocytes after 1h infusion with 19 U of mutGBA enzyme showed an increase of 1.4x, 1.5x and 1.8x, respectively, suggesting mutGBA internalization in these tissues. Finally, it was possible to perform single cell cloning and identification of two clones with higher GBA production in relation to the heterologous population (p <0.05). Clone 5 showed the highest production of mutGBA in the supernatant, 301.4 (+ 4.35) U GBA / ml or 207 (+ 3.23) U GBA/ 106 cells and clone 13 with the highest intracellular production, about 622 (+ 4.35) U GBA / mg protein or 325.5 (+ 3.23) U / 106 cells. In conclusion, L16_293-FT-P2-mutGBA line shows high levels of recombinant &beta-glycosylceramidase production, and the enzyme is active and capable of being internalized by macrophages and biologically active in vivo, thus being a promising cell line for use in ERT.