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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.17.2005.tde-21082007-103139
Document
Author
Full name
Patricia de Oliveira Carminati
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2005
Supervisor
Committee
Hojo, Elza Tiemi Sakamoto (President)
Carlotti Junior, Carlos Gilberto
Salvadori, Daisy Maria Fávero
Title in Portuguese
Respostas celulares aos danos causados pelo antitumoral cisplatina em linhagens de fibroblastos humanos normais (MRC-5) e astrocítica (U343 MG-a).
Keywords in Portuguese
Cisplatina
Expressão Gênica
Gliomas
Abstract in Portuguese
Uma variedade de agentes antitumorais é capaz de induzir danos no material genético e estimular respostas como o bloqueio do ciclo celular, reparo do DNA ou apoptose. A resposta inicial das células é o bloqueio no ciclo em uma tentativa de reparar o dano, no entanto, se esse dano for muito extenso ou comprometer o metabolismo celular, uma cascata de sinalização aciona mecanismos alternativos que inibem a proliferação das células e acionam vias de morte. Os astrocitomas malignos são os tumores cerebrais mais comuns que afetam o sistema nervoso central, compreendendo mais de 60% dos tumores cerebrais primários. O tratamento padrão é a radioterapia seguida de quimioterapia, no entanto, o prognóstico para pacientes portadores desse tipo de câncer ainda continua desanimador. A cisplatina é um agente genotóxico largamente empregado no tratamento de gliomas, além de outros tipos de câncer. Essa droga liga-se ao DNA, formando aductos, os quais levam a um bloqueio na duplicação e na transcrição, podendo induzir apoptose nas células dependendo da extensão do dano. No presente trabalho foram avaliadas as respostas celulares ao tratamento com a cisplatina em linhagem de glioma (U343 MG-a) e em fibroblastos normais transformados por SV40 (MRC-5). Foram avaliadas as respostas em termos de sobrevivência celular, indução de apoptose e expressão gênica em larga escala pela técnica de micro-arranjos de cDNA, sendo esta última realizada somente para a linhagem U343. A cisplatina causou uma redução acentuada na sobrevivência das células MRC-5 (~1%) e U343 (< 1%) após cinco dias de tratamento (teste de sobrevivência celular) com concentrações que variavam de 12,5 a 300 ?M. O tratamento por 24 h com iguais concentrações de cisplatina reduziu a sobrevivência das linhagens em cerca de 20-80% (teste de citotoxicidade). Ambas as linhagens sofreram apoptose após o tratamento com diversas concentrações de cisplatina (12,5, 25 e 50 ?M). A linhagem U343 apresentou uma freqüência máxima de apoptose de 20,4% após o tratamento com 25 ?M de cisplatina por 72 h, enquanto a linhagem MRC-5 apresentou 11,0% de apoptose após 50 ?M de cisplatina por 48 h. Os dados de expressão gênica analisados pelo método de micro-aranjos de cDNA, obtidos 48 h após o tratamento das células U343 com 25 ?M de cisplatina, mostraram genes significativamente (p ?0,05) reprimidos relacionados principalmente com alterações no citoesqueleto (TBCD, RHOA, LIMK2 e MARK1), apoptose ou sobrevivência celular (BCL2-XL, ING1, RHOA, VDP, TIMP2, DYRK3 e NFKBIE), invasão celular ou metástase (LIMK2, TIMP2 e CALU), reparo de DNA (SMC1L1) e metabolismo celular (DYRK3, MARK1, TBCD, LIMK2, VDP e P4HB), entre outros processos. Esses dados apontam para um sério comprometimento da maquinaria celular como um todo após os danos induzidos pela cisplatina. Embora o mecanismo de apoptose justifique cerca de 20% da extensão de morte celular, conforme foi comprovado nos ensaios de apoptose (induzida por 25 ?M de cisplatina), a maior parte das células são eliminadas em conseqüência da ação da droga em vários níveis do metabolismo e manutenção da integridade celular, visto o elevado grau de citotoxicidade da cisplatina, demonstrado nos testes de sobrevivência.
Title in English
Cellular answers to the actual damages for the cisplatina antitumoral in ancestries of normal human fibroblastos (MRC-5) and astrocítica (U343 MG-a).
Keywords in English
Cisplatina
Gênica Expression
Gênica Expression Gliomas
Gliomas
Abstract in English
A variety of antitumoral agents is capable of inducing DNA damage and eliciting cell cycle arrest, DNA repair or apoptotic responses. The initial response is a cell cycle arrest in an attempt to repair the DNA damage, but under conditions of extensive DNA lesions and high drug cytotoxicity, a signaling cascade triggers alternative mechanisms that inhibit cell proliferation and activate cell death pathways. Astrocytomas are the most common neoplasm of the central nervous system, comprising more than 60% of primary brain tumors. The standard treatment for theses tumors are radiotherapy followed by chemotherapy, however, the prognostic for these patients is still very discouraging. Cisplatin is an efficient DNA-damaging antitumor agent employed for the treatment of various human cancers, including gliomas. This drug binds to DNA, producing diverse types of adducts, which can block replication, transcription, and lead to apoptosis induction. In the present work, we analyzed cellular responses to treatments with the anticancer agent cisplatin in MRC-5 (normal human fibroblasts SV40 transformed) and U343 MG-a (glioma cell line). The responses were evaluated in terms of cell survival, apoptosis induction and profiles of gene expression by the cDNA microarrays method (only for U343 cell line). Cisplatin treatment resulted in a pronounced reduction in MRC-5 cell survival (~ 1%) and U343 (< 1%) after five days of treatment (cell survival test) with several concentrations of cisplatin, ranging from 12.5 to 300 ?M. Following 24h of treatment under similar cisplatin concentrations the survival was reduced at about 20-80% (cytotoxicity test). Both cell lines underwent apoptosis after treatment with different concentrations of cisplatin (12.5; 25 and 50 ?M), but U343 cells presented a maximal frequency of 20.4% apoptosis (25 ?M cisplatin treatment for 72h), while MRC-5 cells presented 11.0% (50 ?M cisplatin treatment for 48h). Analysis of gene expression performed for U343 cells treated with 25 ?M cisplatin for 48h showed several genes that were found significantly (p ? 0,05) down-regulated, most of them related with cytoskeleton alterations (TBCD, RHOA, LIMK2 and MARK1), apoptosis or cell survival (BCL2-XL, ING1, RHOA, VDP, TIMP2, DYRK3 and NFKBIE), cell invasion or metastasis (LIMK2, TIMP2 and CALU), DNA repair (SMC1L1), and cell metabolism (DYRK3, MARK1, TBCD, LIMK2, VDP and P4HB), among others. As a whole, these data demonstrate a serious commitment of the cell machinery after cisplatin-induced cellular damage. About 20% of the cell death corresponds to apoptosis, as was showed by the present assays. However, most of the cells are eliminated by the action of the drug in various levels of the metabolism and maintenance of cell integrity, due to the elevated degree of cisplatin citotoxicity, as demonstrated in cell survival tests.
 
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PatriciaCarminati.pdf (894.39 Kbytes)
Publishing Date
2007-08-22
 
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